單底物酶促反應(yīng)

1、單底物酶促反應(yīng)第1頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第一節(jié) 動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo) 酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度與酶和底物間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系。因?yàn)槊负偷孜锸菢?gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動(dòng)力學(xué)關(guān)系是整個(gè)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)。 描寫這種基本動(dòng)力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。v = vmaxS / (Km+S)第2頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反應(yīng)的速度必需測(cè)初速度2、酶活力3

2、、酶活力的表示方法4、酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法 動(dòng)力學(xué)法 檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。第3頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶活力測(cè)定方法 終點(diǎn)法: 酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。 動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度。第4頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二 酶活力的表示方法活力單

3、位（active unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時(shí)間 國(guó)際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個(gè)酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率第5頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度3、pH （最適 pH的概念）4、 溫度 （最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時(shí)，v

4、=kE第6頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線 （MichaelisMenten曲線）米氏方程的提出及推導(dǎo)米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的測(cè)定第7頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平 衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):第8頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線第9頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：ES生成速度

5、：，ES分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：當(dāng)Et=ES時(shí)，(4)所以 第10頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第二節(jié) 米氏方程的討論一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和S的關(guān)系 當(dāng)vVmax時(shí)，v與S無關(guān)，只和E0成正比，這時(shí)表明酶的活性部分已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v0.5Vmax時(shí)，表示活性部位有一半被占據(jù)。當(dāng)一個(gè)酶的Km已知，則任何底物濃度下酶活性部位被占據(jù)的分?jǐn)?shù)：Ys=vVmax=SKm+S稱為該酶促反應(yīng)的相對(duì)速度。第11頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二

6、 米氏方程所作曲線的曲度，不隨Km和Vmax的變化而變化。所以任何酶只要服從米氏方程。則到達(dá)任何兩個(gè)Vmax分?jǐn)?shù)的對(duì)應(yīng)底物濃度之比為一常數(shù)。例如： S0.9 =9 Km，同理S0.1 =1/9 Km，所以： S0.9 / S0.1 9 Km/ 1/9 Km 81，即達(dá)90 Vmax與達(dá)10 Vmax所需底物濃度之比總是81。同樣也可得到達(dá)70 Vmax與達(dá)10 Vmax所需底物濃度之比總是21。 在酶促反應(yīng)初速度區(qū)即在一級(jí)速度區(qū)，由于SKm， v= Vmax S/ Km=k S。從這個(gè)方程可知，一級(jí)速度常數(shù)k = Vmax / Km。0.9 VmaxVmax=S0.9Km+S0.9第12頁(yè)，共

7、31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二k的物理意義：底物在單位時(shí)間轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的量。例如k=0.02min-1，就意味著底物在一分鐘內(nèi)會(huì)有2轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物；若k2.3min-10.0383sec -1 ，那就意味著每秒鐘有3.83的底物變成產(chǎn)物。要測(cè)定任一時(shí)間范圍內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，可用一級(jí)速度方程積分。得：lgS=-kt/2.3+ lgSt第13頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法)將實(shí)驗(yàn)所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和S取倒數(shù)，得各種1/v和1/ S，將1/v對(duì)1/

8、S作圖，得一直線。該直線縱截距1/Vmax，斜率Km/ Vmax，橫截距-1/ Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須注意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km附近。第14頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二1.下圖是根據(jù)S在0.332.0Km范圍時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從此圖可準(zhǔn)確地測(cè)量出-1/Km和1/Vmax等。S在0.332.0 Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第15頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二2.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙

9、倒數(shù)圖的直線基本上是水平的。這種情況雖可測(cè)得1/Vmax ，但由于直線斜率近乎零， -1/Km則難以測(cè)得。S在3.320 Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第16頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二3.如果S比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)都接近原點(diǎn)，使-1/Km 和1/Vmax ，都難以測(cè)準(zhǔn)。S在0.033 0.2Km的范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第17頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程第18頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二2.W

10、oolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：第19頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二3.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程第20頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使S比Km高得多或低得多。 上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個(gè)缺點(diǎn)：第一，在v S圖上，由相等增值而給出的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/v軸附近，而遠(yuǎn)離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是主觀目測(cè)以確定直線最權(quán)重的那

11、些點(diǎn)。第二，在測(cè)定v時(shí)產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時(shí)會(huì)放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/S值所得的一兩個(gè)不準(zhǔn)確的點(diǎn)，會(huì)給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個(gè)缺點(diǎn)可通過選擇適當(dāng)?shù)腟，使1/S為等距離增值而得到克服。對(duì)第二個(gè)缺點(diǎn)關(guān)鍵要注意在低底物濃度下使所測(cè)初速度誤差盡可能減小。第21頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二S/v對(duì)S作圖，S未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對(duì)等距離 S增值所測(cè)數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測(cè)定誤差較大時(shí)使用，比其它方法更可靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是根據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該

12、法是把S值標(biāo)在橫軸的負(fù)半軸上，而把測(cè)得的v值標(biāo)在縱軸上，然后把相應(yīng)的v和S連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點(diǎn)，該交點(diǎn)坐標(biāo)為Km和Vmax。第22頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二四、米氏方程的積分形式及其對(duì)數(shù)據(jù)的處理米氏方程是一個(gè)微分方程，其v=dP/dt或v=-dS/dt。根據(jù)從米氏方程重排得到的線性方程作圖求Km和Vmax時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中所取數(shù)據(jù)必須限于初速度階段，即只能是小于5的St轉(zhuǎn)變?yōu)镻的階段。但有些情況，例如，產(chǎn)物濃度過低難以測(cè)定；或產(chǎn)物根本不能直接測(cè)定，而必須測(cè)定底物濃度的降低來反映產(chǎn)物的量(即PSt-S)。若只限于5的底物發(fā)生反應(yīng)就難以測(cè)準(zhǔn)其降低的量。在

13、這些情況下，如用積分速度方程處理，就不受這種限制。例如，在1090的St轉(zhuǎn)變?yōu)镻的數(shù)據(jù)均可使用。因?yàn)榉e分方程在反應(yīng)全過程中都是準(zhǔn)確的。最簡(jiǎn)單的積分方程是在假定無產(chǎn)物抑制(即KmsKmp)，并且Keq很大的情況下導(dǎo)出:第23頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二重排成各種線性形式，如可直接測(cè)得Vmax /Km和Vmax ，從而可算出Km，這樣的處理方法，可從比Km大幾倍的St (如St 10 Km)開始，將反應(yīng)進(jìn)行到S顯著低于Km(如S=0.1 Km)止。第24頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二五、Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)

14、方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為其中是t這一段時(shí)間內(nèi)的平均速度；為反應(yīng)過程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對(duì)任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過與對(duì)比：第25頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二 從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，即使反應(yīng)已進(jìn)行到30，所引入的誤差也不過1左右。 很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來測(cè)定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。第26頁(yè)，共31頁(yè)，20

15、22年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第四節(jié) 酶的分析和檢測(cè)一、酶促反應(yīng)初速度隨Et的變化酶促反應(yīng)的初速度隨Et的變化而變化。通常在離體測(cè)定條件下， Et一般為10-12 10-7 mol/L，而St為10-6 10-2mol/L。 可將米氏方程轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)S為常數(shù)時(shí)，則初速度v與Et成正比。但一個(gè)酶促反應(yīng)速度，常因S的改變而改變。因此反應(yīng)時(shí)間必須盡可能短，使S幾乎處于恒態(tài)(即只有5以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與 Et之間的關(guān)系才會(huì)是線性的。第27頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二二、酶活力單位和比活力 是指酶在一定作用條件下，單位時(shí)間內(nèi)，使

16、底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反應(yīng)的速度來度量，因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)臈l件下，vE。 為了使酶單位的文獻(xiàn)報(bào)道能統(tǒng)一，并具有可比性，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議曾制訂了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)酶單位。所謂特定條件，溫度定為25，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國(guó)際單位IU)。 酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。第28頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二三、酶的轉(zhuǎn)

17、換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是許多酶為寡聚體。含幾個(gè)亞基，因此可用另一種方式來表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個(gè)值有時(shí)簡(jiǎn)單以min-1表示，即：酶的kp值約在50107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec，即該酶一個(gè)催化周期為1.7微秒。第29頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第五節(jié) 酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反

18、應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究有兩條途徑：一是穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。它是監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)，得到關(guān)于反應(yīng)的籠統(tǒng)信息。二是穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)，它能更直接地研究整個(gè)反應(yīng)中的基本步驟或部分反應(yīng)，提供可用于分析復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制的更有效的數(shù)據(jù)，但需要特殊的儀器來測(cè)量快反應(yīng)。所謂快反應(yīng)，是相對(duì)于普通的混合和觀察方法所需要的時(shí)間而言。完成總反應(yīng)量的一半，即所謂反應(yīng)半時(shí)間，為秒或更短時(shí)間，則屬快反應(yīng)。采用手工混合啟動(dòng)反應(yīng)，用普通的分光光度計(jì)等儀器所能測(cè)量的反應(yīng)半時(shí)間為分和小時(shí)。而酶促反應(yīng)常常是反應(yīng)半時(shí)間短于一秒的快反應(yīng)，采用普通方法是不行的。限制儀器測(cè)定能力的主要因素有：混合樣品并充滿反應(yīng)池所需的時(shí)間，觀察和記錄變化所需的第30頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)21