單底物酶促反應(yīng)

1、單底物酶促反應(yīng)第1頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第一節(jié) 動力學(xué)方程推導(dǎo) 酶反應(yīng)的基本動力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度與酶和底物間的動力學(xué)關(guān)系。因為酶和底物是構(gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動力學(xué)關(guān)系是整個酶反應(yīng)動力學(xué)的基礎(chǔ)。 描寫這種基本動力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。v = vmaxS / (Km+S)第2頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶促反應(yīng)速度的測定與酶的活力單位1、測定酶促反應(yīng)的速度必需測初速度2、酶活力3

2、、酶活力的表示方法4、酶活力測定方法：終點(diǎn)法 動力學(xué)法 檢測酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。第3頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶活力測定方法 終點(diǎn)法: 酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。 動力學(xué)法:連續(xù)測定反應(yīng)過程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測定出酶反應(yīng)的初速度。第4頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二 酶活力的表示方法活力單

3、位（active unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時間 國際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率第5頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二各種因素對酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度3、pH （最適 pH的概念）4、 溫度 （最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時，v

4、=kE第6頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線 （MichaelisMenten曲線）米氏方程的提出及推導(dǎo)米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的測定第7頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平 衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):第8頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線第9頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：ES生成速度

5、：，ES分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時：當(dāng)Et=ES時，(4)所以 第10頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第二節(jié) 米氏方程的討論一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和S的關(guān)系 當(dāng)vVmax時，v與S無關(guān)，只和E0成正比，這時表明酶的活性部分已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v0.5Vmax時，表示活性部位有一半被占據(jù)。當(dāng)一個酶的Km已知，則任何底物濃度下酶活性部位被占據(jù)的分?jǐn)?shù)：Ys=vVmax=SKm+S稱為該酶促反應(yīng)的相對速度。第11頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二

6、 米氏方程所作曲線的曲度，不隨Km和Vmax的變化而變化。所以任何酶只要服從米氏方程。則到達(dá)任何兩個Vmax分?jǐn)?shù)的對應(yīng)底物濃度之比為一常數(shù)。例如： S0.9 =9 Km，同理S0.1 =1/9 Km，所以： S0.9 / S0.1 9 Km/ 1/9 Km 81，即達(dá)90 Vmax與達(dá)10 Vmax所需底物濃度之比總是81。同樣也可得到達(dá)70 Vmax與達(dá)10 Vmax所需底物濃度之比總是21。 在酶促反應(yīng)初速度區(qū)即在一級速度區(qū)，由于SKm， v= Vmax S/ Km=k S。從這個方程可知，一級速度常數(shù)k = Vmax / Km。0.9 VmaxVmax=S0.9Km+S0.9第12頁，共

7、31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二k的物理意義：底物在單位時間轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的量。例如k=0.02min-1，就意味著底物在一分鐘內(nèi)會有2轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物；若k2.3min-10.0383sec -1 ，那就意味著每秒鐘有3.83的底物變成產(chǎn)物。要測定任一時間范圍內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，可用一級速度方程積分。得：lgS=-kt/2.3+ lgSt第13頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第三節(jié) 實驗數(shù)據(jù)的處理分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法)將實驗所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和S取倒數(shù)，得各種1/v和1/ S，將1/v對1/

8、S作圖，得一直線。該直線縱截距1/Vmax，斜率Km/ Vmax，橫截距-1/ Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實驗數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動力學(xué)常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實驗時必須注意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km附近。第14頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二1.下圖是根據(jù)S在0.332.0Km范圍時的實驗結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從此圖可準(zhǔn)確地測量出-1/Km和1/Vmax等。S在0.332.0 Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第15頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二2.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙

9、倒數(shù)圖的直線基本上是水平的。這種情況雖可測得1/Vmax ，但由于直線斜率近乎零， -1/Km則難以測得。S在3.320 Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第16頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二3.如果S比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)都接近原點(diǎn)，使-1/Km 和1/Vmax ，都難以測準(zhǔn)。S在0.033 0.2Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。第17頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程第18頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二2.W

10、oolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：第19頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二3.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程第20頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使S比Km高得多或低得多。 上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個缺點(diǎn)：第一，在v S圖上，由相等增值而給出的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/v軸附近，而遠(yuǎn)離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是主觀目測以確定直線最權(quán)重的那

11、些點(diǎn)。第二，在測定v時產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時會放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/S值所得的一兩個不準(zhǔn)確的點(diǎn)，會給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個缺點(diǎn)可通過選擇適當(dāng)?shù)腟，使1/S為等距離增值而得到克服。對第二個缺點(diǎn)關(guān)鍵要注意在低底物濃度下使所測初速度誤差盡可能減小。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二S/v對S作圖，S未取倒數(shù)。另兩個線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對等距離 S增值所測數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測定誤差較大時使用，比其它方法更可靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是根據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該

12、法是把S值標(biāo)在橫軸的負(fù)半軸上，而把測得的v值標(biāo)在縱軸上，然后把相應(yīng)的v和S連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點(diǎn)，該交點(diǎn)坐標(biāo)為Km和Vmax。第22頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二四、米氏方程的積分形式及其對數(shù)據(jù)的處理米氏方程是一個微分方程，其v=dP/dt或v=-dS/dt。根據(jù)從米氏方程重排得到的線性方程作圖求Km和Vmax時，在實驗過程中所取數(shù)據(jù)必須限于初速度階段，即只能是小于5的St轉(zhuǎn)變?yōu)镻的階段。但有些情況，例如，產(chǎn)物濃度過低難以測定；或產(chǎn)物根本不能直接測定，而必須測定底物濃度的降低來反映產(chǎn)物的量(即PSt-S)。若只限于5的底物發(fā)生反應(yīng)就難以測準(zhǔn)其降低的量。在

13、這些情況下，如用積分速度方程處理，就不受這種限制。例如，在1090的St轉(zhuǎn)變?yōu)镻的數(shù)據(jù)均可使用。因為積分方程在反應(yīng)全過程中都是準(zhǔn)確的。最簡單的積分方程是在假定無產(chǎn)物抑制(即KmsKmp)，并且Keq很大的情況下導(dǎo)出:第23頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二重排成各種線性形式，如可直接測得Vmax /Km和Vmax ，從而可算出Km，這樣的處理方法，可從比Km大幾倍的St (如St 10 Km)開始，將反應(yīng)進(jìn)行到S顯著低于Km(如S=0.1 Km)止。第24頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二五、Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)

14、方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為其中是t這一段時間內(nèi)的平均速度；為反應(yīng)過程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過與對比：第25頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二 從以上計算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理實驗數(shù)據(jù)時，即使反應(yīng)已進(jìn)行到30，所引入的誤差也不過1左右。 很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實驗數(shù)據(jù)來測定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。第26頁，共31頁，20

15、22年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第四節(jié) 酶的分析和檢測一、酶促反應(yīng)初速度隨Et的變化酶促反應(yīng)的初速度隨Et的變化而變化。通常在離體測定條件下， Et一般為10-12 10-7 mol/L，而St為10-6 10-2mol/L。 可將米氏方程轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)S為常數(shù)時，則初速度v與Et成正比。但一個酶促反應(yīng)速度，常因S的改變而改變。因此反應(yīng)時間必須盡可能短，使S幾乎處于恒態(tài)(即只有5以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與 Et之間的關(guān)系才會是線性的。第27頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二二、酶活力單位和比活力 是指酶在一定作用條件下，單位時間內(nèi)，使

16、底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反應(yīng)的速度來度量，因為在適當(dāng)?shù)臈l件下，vE。 為了使酶單位的文獻(xiàn)報道能統(tǒng)一，并具有可比性，國際酶學(xué)會議曾制訂了一個標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個酶單位。所謂特定條件，溫度定為25，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國際單位IU)。 酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。第28頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二三、酶的轉(zhuǎn)

17、換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是許多酶為寡聚體。含幾個亞基，因此可用另一種方式來表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個值有時簡單以min-1表示，即：酶的kp值約在50107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec，即該酶一個催化周期為1.7微秒。第29頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21分，星期二第五節(jié) 酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反

18、應(yīng)動力學(xué)研究有兩條途徑：一是穩(wěn)態(tài)動力學(xué)。它是監(jiān)測整個反應(yīng)，得到關(guān)于反應(yīng)的籠統(tǒng)信息。二是穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)，它能更直接地研究整個反應(yīng)中的基本步驟或部分反應(yīng)，提供可用于分析復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制的更有效的數(shù)據(jù)，但需要特殊的儀器來測量快反應(yīng)。所謂快反應(yīng)，是相對于普通的混合和觀察方法所需要的時間而言。完成總反應(yīng)量的一半，即所謂反應(yīng)半時間，為秒或更短時間，則屬快反應(yīng)。采用手工混合啟動反應(yīng)，用普通的分光光度計等儀器所能測量的反應(yīng)半時間為分和小時。而酶促反應(yīng)常常是反應(yīng)半時間短于一秒的快反應(yīng)，采用普通方法是不行的。限制儀器測定能力的主要因素有：混合樣品并充滿反應(yīng)池所需的時間，觀察和記錄變化所需的第30頁，共31頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)21