檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析

1、檀噴鼻萜烯分解酶基果的克隆與序列闡收文海濤，趙黑英，林勵(lì)，邱賢秀【關(guān)鍵詞】檀噴鼻;萜烯分解酶;基果克隆;序列闡收Keyrds:SantalualbuL.;terpenesynthase;genelning;sequeneanalysis貴重中藥檀噴鼻為檀噴鼻科動(dòng)物檀噴鼻(SantalualbuL.)的樹干心材，為止氣溫中、開胃止痛之經(jīng)常使用中藥1。檀噴鼻本產(chǎn)于印度、印度僧西亞等天，1962工夫北動(dòng)物園從印僧引種檀噴鼻并正在廣東天域試種成功2。檀噴鼻正在自然死少情況下需10年左右才華初步構(gòu)成具有芬芳?xì)庀⒌男牟?雅稱結(jié)噴鼻)，30年以上才華供藥用，檀噴鼻心材揮收油是其主要活性成分，已有研討說明檀噴

2、鼻揮收油主要成分為萜烯類化開物，其中檀噴鼻醇等倍半萜烯類占揮收油總量的60%80%3。如今國(guó)內(nèi)外對(duì)檀噴鼻研討的報(bào)導(dǎo)主要會(huì)集于檀噴鼻栽種妙技戰(zhàn)檀噴鼻揮收油組分闡收上4，而對(duì)檀噴鼻心材揮收油儲(chǔ)蓄積累機(jī)理卻陳睹報(bào)導(dǎo)。鑒于此，本研討擬對(duì)參與檀噴鼻萜烯類化開物死物分解過程中的關(guān)鍵酶萜烯分解酶基果舉止克隆戰(zhàn)闡收。萜類物量的前體同戊烯基焦磷酸正在萜烯分解酶的做用下構(gòu)成不同的萜類骨架，經(jīng)過不同建飾酶的做用后構(gòu)成不同的萜類化開物，該酶基果的克隆將為闡收檀噴鼻揮收油儲(chǔ)蓄積累的機(jī)理供應(yīng)實(shí)際支撐，同時(shí)也為利用基果工程本領(lǐng)培育檀噴鼻良種、膨脹檀噴鼻死終年限和前進(jìn)檀噴鼻揮收油露量等圓里研討奠定穩(wěn)固的基矗1材料與要收1.1

3、材料戰(zhàn)試劑1.2要收參照hang等5要收舉止提與并稍減改進(jìn)。改進(jìn)的地方為用三氯甲烷/同戊醇(241)抽提兩次、用10lL-1Lil沉淀過夜，其他不變。采與Takara公司PrieSriptT1stStrandDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄RNA成DNA。步伐為：(1)正在離心管中順次參與總RNA4L，lig(DT)1L，dNTP(10lL-1)1L，減RNasefreeater至整體積10L;(2)65連結(jié)5in，火速與出冰上擺設(shè)3in;(3)按順次分別參與5Buffer4L，RNaseinhibitr0.5L，RNasefreeater4.5L，PrieSriptRTase1L，42保

4、溫1h，70滅活15in。于-20保存?zhèn)溆?。PR擴(kuò)刪前提：94，4in;94，50s，59，50s，72，2in;34輪回;72，10in。2結(jié)果與闡收2.1檀噴鼻心材總RNA提與采與TAB提嫁Lil沉淀法提與的檀噴鼻心材總RNA，經(jīng)1.0%甲醛變性凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，提與的檀噴鼻心材總RNA其28S戰(zhàn)18S條帶較清楚，稍有降解。用核酸卵黑儀測(cè)定RNA的量量，結(jié)果其A260/A280值均正在1.62.0之間，A260/A230的值正在2.02.3之間，分析此要收提與的RNA量量較好，可以用于后絕真止。2.2檀噴鼻萜烯分解酶基果克隆2.3檀噴鼻萜烯分解酶基果序列闡收將經(jīng)初

5、步斷定的陽(yáng)性克隆支英濰捷基公司測(cè)序，經(jīng)由過程序列拼接后獲得齊少為1812bp的序列，露有1731bp編碼區(qū)，編碼576個(gè)氨基酸殘基，重命名為TPS1。利用NBI中的BLASTn舉止序列比對(duì)，創(chuàng)造該序列與已正在GenBank登錄的一個(gè)一樣去自于檀噴鼻(黑檀)的單萜分解酶基果序列(EU798692)同源性為99%，正在部分1731個(gè)堿基中只要6個(gè)存正在不同。兩個(gè)序列編碼的氨基酸序列比對(duì)后創(chuàng)造，其同源性一樣為99%，氨基酸殘基正在4個(gè)位面上存正在不同，分別是53位S/T、529位H/Y、439位T/I戰(zhàn)515位D/G，此外兩個(gè)氨基酸序列皆具有動(dòng)物萜烯分解酶家眷的保守天域。果而初步揣度本研討獲得的基因?yàn)樘磭姳禽葡┓纸饷富?會(huì)商本研討獲得了一個(gè)