DB11-T375-2017水生動物檢疫名錄及病原檢測方法

1、ICS 65.150B 50備案號:54157-2017DB11北京市地方標準DB11/T 3752017代替 DB11/T 375-2006水Th動物檢疫名錄及病原檢測方法List of aquatic animal diseases and its detection method2017 - 03 - 22 發(fā)布2017 - 07 - 01 實施北京市質量技術監(jiān)督局發(fā) 布DB11/T 3752017前言本標準按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標準替代DB11/T 3752006水生動物檢疫名錄及病原檢測方法，與DB11/T 3752006相比， 除編輯性修改外主要技術變化如下

2、：修改了標準適用范圍(見 1)；修改了檢疫名錄(見 3,2006 年版的 3)；修改了病原檢測方法（見 4.2,2006 年版的 4）；刪除了資料性附錄 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J（見 2006 年版的附錄 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J）；刪除了結果報告單（見 2006 年版的 5）；增加了采樣、抽樣規(guī)格、抽樣水溫的規(guī)定(見 4.1)；增加了資料性附錄 A“鯽造血器官壞死病診斷規(guī)程” （見附錄 A）。請注意文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由北京市農(nóng)業(yè)局提出并歸口。本標準由北京市農(nóng)業(yè)局組織實施。本標準起草單位：北京市水產(chǎn)技術推廣站

3、。本標準主要起草人：曹歡、王姝、王小亮、王靜波、曹潔、徐立蒲、那立海、賈麗、張文、王澎。本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為:DB11/T 3752006。IDB11/T 3752017水Th動物檢疫名錄及病原檢測方法范圍本標準給出了水生動物檢疫名錄及病原檢測的方法。本標準適用于水生動物檢疫以及相關疫病的監(jiān)測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15805.1魚類檢疫方法 第1部分：傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)GB/T15805.2魚類檢疫方法 第2

4、部分：傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)GB/T15805.4魚類檢疫方法 第4部分：斑點叉尾鮰病毒(CCV)GB/T15805.5魚類檢疫方法 第5部分：鯉春病毒血癥病毒(SVCV)SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術規(guī)范SC/T7212.1鯉皰疹病毒檢測方法 第1部分：錦鯉皰疹病毒SN/T2503淡水魚中寄生蟲檢疫技術規(guī)范SN/T3584草魚出血病檢疫技術規(guī)范檢疫名錄檢疫對象及其相應的檢疫范圍見表1。表1檢疫名錄序號檢疫對象檢疫范圍1鯉春病毒血癥（Spring viraemia of carp，SVC）鯉魚、錦鯉、金魚等鯉科魚類2草魚出血?。℉emorrhage disease of

5、grass carp，GCRV）青魚、草魚3傳染 性 造 血 器官 壞死 ?。?Infectious haematopoieticnecrosis ,IHN）虹鱒等冷水性鮭科魚類4錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpesvirus disease，KHVD）鯉、錦鯉5鯽造血器官壞死?。℅oldfish haematopoietic necrosis ,GFHN）金魚、鯽6傳染性胰臟壞死?。↖nfectious pancreatic necrosis ,IPN）虹鱒等冷水性鮭科魚類7斑點叉尾鮰病毒?。╟hannel catfish virus disease ,CCVD）斑點叉尾鮰8小瓜蟲?。↖ch

6、thyophthiriasis）淡水魚類病原檢測采樣方法1DB11/T 3752017采樣按照SC/T 7103的規(guī)定執(zhí)行，抽樣規(guī)格及抽樣水溫見表2。表2抽樣規(guī)格及抽樣水溫序號檢 疫 對 象抽樣 規(guī) 格抽樣 水 溫1鯉春病毒血癥苗種或成魚10202草魚出血病苗種或成魚20303傳染性造血器官壞死病6 月齡以下苗種8154錦鯉皰疹病毒病苗種或成魚20305鯽造血器官壞死病苗種或成魚15266傳染性胰臟壞死病3 月齡以下苗種10147斑點叉尾鮰病毒病苗種或成魚25308小瓜蟲病苗種或成魚1525檢測方法病原檢測方法見表3。表3檢測方法序號檢 疫 對 象檢 測 方 法1鯉春病毒血癥GB/T 1580

7、5.52草魚出血病SN/T 35843傳染性造血器官壞死病GB/T 15805.24錦鯉皰疹病毒病SC/T 7212.15鯽造血器官壞死病見附錄 A6傳染性胰臟壞死病GB/T 15805.17斑點叉尾鮰病毒病GB/T 15805.48小瓜蟲病SN/T 25032DB11/T 3752017附錄A（資料性附錄）鯽造血器官壞死病診斷規(guī)程病原鯽造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）。樣品要求水溫采集樣品時的水溫應在1526。品種采樣品種為金魚、鯽及其雜交種。優(yōu)先采集金魚，其次為鯽魚，及其它雜交品種。數(shù)量按照SC/T 7103 執(zhí)行

8、。狀態(tài)已死亡魚樣不采集。信息采集需采集金魚、鯽及其雜交種發(fā)病情況、混養(yǎng)其它魚類發(fā)病情況、采樣水溫等信息。臨床癥狀及流行病學特征臨床癥狀患金魚造血器官壞死病的金魚、鯽，特別是雜交種，具有下列臨床癥狀：最顯著的特征為鰓部嚴重充血, 瀕死病魚鰓部開始大量出血，血液不斷的順著鰓絲流到體外；體表、下頜等處分布大量點狀出血點；病魚沒有生氣，不吃食，在水面緩游，病情嚴重時由于嚴重貧血使得鰓明顯退色，皮膚和鰓上有白色斑塊，癥狀和錦鯉發(fā)生的錦鯉皰疹病毒病不同；將病魚解剖后可見其肝發(fā)白，脾和腎腫大，脾上有白色結節(jié)。流行病學特征患金魚造血器官壞死病的金魚、鯽，特別是雜交種，具有下列流行病學特征：GFHNV 具有較高

9、的傳染性，但它的感染譜較小，僅感染金魚、鯽，特別是雜交種；該病流行的水溫適宜范圍為 1526，即當池塘水溫自然上升至 15時，疾病開始發(fā)生，而繼續(xù)上升至 26以上時，這種疾病發(fā)生率會大幅度下降；而當秋季溫度開始下降，特別是降3DB11/T 3752017低到 26以下時會再次流行；該病嚴重時死亡率較高(可以達 90%以上)；被感染的魚可以長期帶毒。實驗室檢測試劑和材料水：符合GB/T 6682中一級水的規(guī)格。GFHNV陽性樣品：符合國家有關規(guī)定。Taq酶：20保存，不能反復凍融或溫度劇烈變化。dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoL/L。MgCl2：25 mmoL/L

10、。引物：濃度為100 pmoL/L。其序列如下：CyHV-pol-F：5-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3；CyHV-pol-R：5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。擴增 CyHV 1-3 型 pol 基因 362 bp 片段。引物：濃度為100 pmoL/L。其序列如下：GFHVN-F：5-CTACACGCCTCGCATCAT-3；GFHVN-R：5-CTCCACGGTCCTCATCTT-3。擴增 GFHNV DNA helicase 基因 451 bp 片段。器材和設備普通冰箱和超低溫冰箱。組織研磨器。離心機和離心管。PCR擴增儀。水平電泳儀。微量移液器及吸頭。紫

11、外觀察燈或凝膠成像儀。樣品處理取腎、脾、鰓和腦組織，成熟雌魚還需取卵巢液。將所取樣品勻漿成糊狀，按1：10的最終稀釋度懸于磷酸鹽緩沖液或M199細胞培養(yǎng)液。DNA抽提CTAB+酚/氯仿/異戊醇抽提法將450L懸液放入1.5mL的離心管，再加入450L CTAB溶液并混勻，25作用2小時。在含有樣品的離心管中加入600L抽提液，用力混合。12000r/min離心5min，取上層水相（約800L）。再加入700L抽提液，用力混合。12000r/min離心5min，取上層水相（約600L）。再加入預冷的1.5倍體積的無水乙醇（約900L），倒置數(shù)次混勻后，放置離心管于20下，至少8h后取出。1200

12、0r/min 離心30min，倒去上清液。將離心管倒置于吸水紙上，吸干液體。加11L DEPC水溶解后，作為PCR模板。4DB11/T 3752017DNAzol抽提法將100L懸液放入1.5ml的離心管，再加入1ml DNAzol，顛倒混勻5次，室溫下靜置5min，10600g（11400r/min）離心10min；吸取上清約1ml，加入0.5ml無水乙醇，顛倒混勻5次，室溫下靜置5min，18000g（15000r/min）離心30min；吸棄上清，加入500L 75%的乙醇清洗，18000g（15000r/min）離心5min； 吸棄乙醇，干燥5min；加入50L DEPC水（60預熱）

13、，60保溫5min；即為提取的DNA，作為PCR 模板。DNA提取試劑盒抽提法具體參照試劑盒說明書。DNA擴增擴增CyHV pol基因反應體系為100L：在0.2mL反應管中加入10L模板、 2.5L dNTP、10 L 氯化鎂溶液、10L 10倍Taq酶緩沖液、CyHV-pol-R和CyHV-pol-F各1L、2.5U Taq酶、加DEPC水至100L。將反應管置于PCR擴增儀。反應程序：94變性5min；94變性1min、60退火1min、72 延伸1min，40次循環(huán)；72延伸10min；4保溫。擴增GFHNV DNA helicase基因的反應體系為100L：在0.2mL反應管中加入1

14、0L模板、2.5 L dNTP、10L氯化鎂溶液、10L 10倍Taq酶緩沖液、GFHNV-R和GFHNV-F各1L、2.5U Taq酶、加D EPC水至100L。將反應管置于PCR擴增儀。反應程序：94變性5min；94變性1min、55退火1min、72延伸1min，40次循環(huán)；72延伸10min；4保溫。設立對照在6.3樣品處理過程中應設立陽性樣品對照、陰性樣品對照、空白對照。取GFHNV陽性樣品抽提核酸作為陽性對照。取正常的魚組織抽提核酸作為陰性對照。取等體積的水代替模板作為空白對照。瓊脂糖電泳用TBE電泳緩沖液，配制1.5%的瓊脂糖平板（含1L/mL EB）。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將6L樣品和2L上樣緩沖液，按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時使用核酸分子量標準參考物作對照。5V/cm電泳約0.5h,當溴酚藍到達底部時停止。在紫外觀察燈下或用凝膠成像儀觀察擴增帶并判斷結果。測序取362bp DNA片段PCR產(chǎn)物進行基因序列測定，將測序結果與GenBank中參考序列進行同源性比對。結果判定PCR后陽性對照會出現(xiàn)一條362 bp