COL1a1、COL3a1在發(fā)育性髖脫位患兒圓韌帶的表達(dá)

1、COL1a1、COL3a1在發(fā)育性髖脫位患兒圓韌帶的表達(dá)王恩波，趙群，李連永，史立偉，李建軍，高紅【摘要】目的探求發(fā)育性髖脫位(develpentaldislatinfthehip,DDH)患兒與正常兒圓韌帶中、型膠原在RNA及蛋白水平的表達(dá)差異。方法選取性別相同年齡相近的6對(duì)發(fā)育性髖脫位患者及正常兒配對(duì)比較。采用半定量RT-PR及estern-Blt法檢測(cè)L1a1、L3a1在RNA及蛋白水平的表達(dá)。圖像分析軟件進(jìn)行量化分析，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果L1a1在DDH組RNA及蛋白水平表達(dá)均較正常對(duì)照組降低(P0.01)；L3a1在DDH組RNA及蛋白水平表達(dá)與正常對(duì)照組無顯著差異(P0.05)。結(jié)

2、論DDH患兒圓韌帶中I型膠原在RNA及蛋白水平表達(dá)較正常同性同齡兒降低，可能是導(dǎo)致DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的原因。DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛可能與型膠原含量無關(guān)。【關(guān)鍵詞】發(fā)育性髖脫位；圓韌帶；關(guān)節(jié)松弛；膠原Abstrat:bjetiveTinvestigatetheexpressinfllagentypeIandIIIatRNAandprtEinlevelintheligaentuteresfdevelpentaldislatinfthehip(DDH)andthenralhip.ethdThereere6pairsjintlaxityfpatientsfDDHgrupandnralntrlgrupi

3、thpairedntrlfsaesexandage.SeiquantityRT-PRethdasusedtdetettheLlalandL3alintheligaentuteresatRNAlevel.estern-BltethdasusedtdetettheLlalandL3alintheligaentuteresatprteinlevel.ThequantitativeanalysisftheLlalandL3alereperfredbyprfessinaliagesftareandtheresultsereanalyzedithstandardstatistialethds.Result

4、AtbthRNAandprteinlevelLlalexpressineredereasedintheDDHgrupparedtthentrlgrup(P0.01).ThereasnsignifiantdifferenefrL3albeteenDDHandntrlgrupateitherRNArprteinlevel(P0.05).nlusinThedereasedllagenIexpressinatRNAandprteinlevelintheligaentuteresfthehildrenithDDHayleadthipjintlaxity.HipjintlaxityinDDHaybeind

5、ependenttthententfllagenIII.Keyrds：develpentaldislatinfthehip;jintlaxity;ligaentuteres;llagen關(guān)節(jié)囊與韌帶松弛是導(dǎo)致發(fā)育性髖脫位(develpentaldislatinfthehip,DDH)的主要因素之一。膠原纖維是構(gòu)成圓韌帶中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，并使其保持一定的強(qiáng)度和韌性。各型膠原結(jié)構(gòu)和(或)含量的變化可能會(huì)導(dǎo)致其拉伸增強(qiáng)作用下降，發(fā)生關(guān)節(jié)松弛。目前關(guān)于DDH圓韌帶內(nèi)膠原蛋白的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)比較、型膠原在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)差異。試圖從分子水平揭示DDH患兒髖

6、關(guān)節(jié)松弛的機(jī)理。1材料和方法1.1標(biāo)本來源及制備DDH組髖圓韌帶標(biāo)本6例，均無家族史，不合并其他畸形。來源方式：手術(shù)復(fù)位中切除的患髖圓韌帶。與DDH組性別相同年齡相近(6個(gè)月)正常兒童髖關(guān)節(jié)圓韌帶6例。來源方式：4例來源于股骨頸腫瘤手術(shù)切除之圓韌帶，2例來源于意外死亡后尸檢。取材部位及方法同DDH組。以上標(biāo)本獲取均獲得監(jiān)護(hù)人書面授權(quán)，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)書面認(rèn)可。剪取原韌帶中間13部分深低溫保存。1.2半定量RT-PR1.2.1組織總RNA提取圓韌帶組織總RNA提取按照Invitrgen公司(美國(guó))提取試劑盒說明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度，純度為1.691.94。1.2.2逆轉(zhuǎn)

7、錄合成DNA參照TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA公司)說明書進(jìn)行。在20l反應(yīng)體系中另加入樣本RNA模板2l,2Buffer10l；25l/LgS44l；10l/LdNTPs1l；22ulAV1l；50l/Llig-dT1l；40uIRNaseinhibitr0.5l；ddH200.5l?；靹蚝笾糜谙铝袦囟确磻?yīng)：651in，305in，于30in勻速升溫至65，6530in，985in，55in。1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)在25l反應(yīng)體系中，分別加入：DNA；ddH20；PRbuffer(10)；dNTPs(各2.5l/L)；TaqDNA聚合酶(5ul)；待測(cè)指標(biāo)的上游引物和下游引物

8、(上海英俊生物公司)；引物終濃度為520pl/L。各指標(biāo)及內(nèi)參GAPDH引物的序列、擴(kuò)增條件見表1。表1PR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度引物名稱核苷酸序列產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)Genebank循環(huán)條件Llal上游5-AAATAATGAGTGGT-3下游5-TTGTTGGTTGTTT-3509B036531943in，9430s6540s，721in35個(gè)循環(huán)后，727inL3al上游5-AGAAATAATATA-3下游5-AAGAGGAAAATATGGAG-3366N000090943in，9030s5840s，721in35個(gè)循環(huán)后，727inGAPDH上游5-TGAAGGGAAGTATGG-3下游5-TA

9、ATGTTGTGTA-3307XR018317953in，9530s6030s，721in40個(gè)循環(huán)后，727in1.2.4PR產(chǎn)物電泳及檢測(cè)取反應(yīng)產(chǎn)物10l在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下檢查特異條帶，1Dkdar成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用Siniage軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行半定量分析。1.3estern-blt1.3.1膠原標(biāo)本制備標(biāo)本稱重，在酸性條件下(0.5l/L乙酸,pH2.5)以10%胃蛋白酶消化22h。-419000r/in離心1h，2l/LNal加入上清，-419000r/in離心1h，上清即為可溶膠原。1.3.2蛋白定量按酚試劑法測(cè)定并調(diào)平蛋白質(zhì)濃度。1.3.3變性加入2%

10、-巰基乙醇100變性1in。1.3.4電泳取20l蛋白上樣，經(jīng)7.5%聚丙烯酞胺凝膠(SDS)電泳2h，電壓130v。1.3.5轉(zhuǎn)膜將PAGE凝膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，2h，電壓40v。1.3.6封閉TBS洗膜1次，加入含8%BSA的TTBS4過夜。1.3.7一抗孵育TBS洗膜3次，每次5in，分別加入山羊抗人、兔抗人多克隆抗體(11000)(Santa公司，美國(guó))，室溫下2h。1.3.8二抗孵育加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1200)(北京中山生物公司)，室溫4h。1.3.9顯色以堿性磷酸酶染色液染色。1.3.10結(jié)果分析用自動(dòng)電泳凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用SinIage軟件

11、對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS軟件(10.0版本，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。配對(duì)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1RT-PRDDH組小兒圓韌帶L1a1RNA的表達(dá)較對(duì)照組降低(P0.01)；L3a1RNA表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異(P0.05)。見圖1及表2。2.2estern-bltDDH組小兒圓韌帶L1a1的蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低(P0.01)，L3a1的蛋白表達(dá)與對(duì)照組無顯著差異(P0.05)，見圖2及表3。表26對(duì)DDH組與對(duì)照組小兒圓韌帶L1a1、L3a1RNA的表達(dá)編號(hào)性別DDH組對(duì)照組年齡（歲）L1a1/GAPDH*L3a1/GAP

12、DH*年齡（歲）L1a1/GAPDH*L3a1/GAPDH*1男3.10.410.592.61.070.822女3.30.440.662.80.720.633女4.90.580.665.00.890.684男5.00.290.865.00.770.825女6.70.430.757.11.040.716女9.20.410.738.80.980.75配對(duì)T檢驗(yàn)：*P=0.001；*P=0.556表36對(duì)DDH組與對(duì)照組小兒圓韌帶L1a1和L3a1的蛋白表達(dá)差異編號(hào)性別DDH組對(duì)照組年齡3討論以往的研究發(fā)現(xiàn)髖脫位患兒多伴有關(guān)節(jié)松弛，這與髖脫位術(shù)中所見松弛薄弱的關(guān)節(jié)囊與圓韌帶相符。因此髖關(guān)節(jié)松弛是導(dǎo)致

13、髖脫位主要因素之一也得到了普便認(rèn)同1。但作為杵臼關(guān)節(jié)的髖關(guān)節(jié)要保持穩(wěn)定，主要依靠骨的形態(tài)，而關(guān)節(jié)囊及圓韌帶則能保持它們固定于正常的位置。人類出生時(shí)髖臼較淺，股骨頭表面為平滑弧線，出生后髖臼不斷加深，股骨頭弧度加大，髖關(guān)節(jié)逐漸穩(wěn)定，而這需要頭臼同心的相互作用才能達(dá)到。而關(guān)節(jié)囊和圓韌帶則具有保持這種頭臼同心位置的重要作用。構(gòu)成圓韌帶并發(fā)揮抗生物張力生理功能的主要成分是膠原纖維。膠原是人體中最為豐富，分布最為廣泛的一組糖蛋白分子，約占人體蛋白總量的30%。膠原分子是由三條多肽鏈形成的一種特殊的右手三螺旋結(jié)構(gòu)，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為兩大類2：即經(jīng)典的纖維形成膠原和非纖維形成膠原。、型是最為經(jīng)典纖維形成膠

14、原。這三種膠原約占體內(nèi)總膠原的80%90%，因此也成為研究的重點(diǎn)。膠原分子主要由成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等合成、分泌。具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原分子被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外通過共價(jià)鍵相互交聯(lián)形成膠原纖維3。圓韌帶主要由、型膠原參與構(gòu)建，型膠原分子式為1()3或1()22()，型膠原分子式為1()3，因此1()、1()可以分別代表I、型膠原的含量4。Bland于2001年發(fā)表了關(guān)于家兔髖關(guān)節(jié)發(fā)育過程中膠原變化的研究5。該研究主要應(yīng)用免疫組化及原位雜交的方法，觀察了從17d胎兔至2歲成年兔圓韌帶中膠原的分布及演變規(guī)律：17d胎兔可分辨圓韌帶，在發(fā)育的初始階段為I、V型膠原遍布圓韌帶，型膠原僅局限于韌帶表面及止點(diǎn)處，韌

15、帶內(nèi)細(xì)胞表達(dá)I型膠原RNA，出生后這種分布仍然保持，但型膠原也開始遍布圓韌帶。成年后家兔圓韌帶已被含有、V型膠原的鞘所包被。I型膠原成束狀大量分布，具有強(qiáng)大的抗張能力。型膠原成網(wǎng)格樣分布，可保持組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)。到目前為止，I、型膠原成為韌帶組織膠原研究的重點(diǎn)。成纖維細(xì)胞是圓韌帶的主要細(xì)胞成分，具有強(qiáng)大的膠原分泌功能。由于膠原分子在細(xì)胞內(nèi)合成后要轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外組裝成膠原纖維，因此在功能旺盛的成纖維細(xì)胞周圍會(huì)出現(xiàn)環(huán)繞的膠原分子。這些細(xì)胞占全體成纖維細(xì)胞的比例就反映出纖維層I型膠原的合成能力。既往DDH關(guān)節(jié)囊免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)有陽性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)與年齡呈負(fù)相關(guān)，即年齡越小百分比越大，合成能力越強(qiáng)

16、，隨著年齡增大，合成能力降低6。本研究RT-PR的結(jié)果顯示DDH組圓韌帶的成纖維細(xì)胞I型膠原RNA表達(dá)量亦降低，表明DDH組圓韌帶成纖維細(xì)胞在I型膠原轉(zhuǎn)錄水平的降低。目前為止關(guān)于DDH圓韌帶中膠原RNA水平的變化未見相關(guān)報(bào)道。關(guān)節(jié)過度活動(dòng)系由關(guān)節(jié)囊及韌帶松弛而來，有許多學(xué)者推測(cè)它很可能與某些細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān)，如膠原、彈力纖維等1。Rde等7對(duì)肩關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定患者的肩關(guān)節(jié)囊的膠原和彈力纖維進(jìn)行了如下研究：（1）定量分析穩(wěn)定的還原膠原交叉鍵；（2）氨基酸分析；（3）測(cè)量膠原纖維的直徑和強(qiáng)度；（4）免疫組化定量彈性蛋白和原纖維。驗(yàn)證了肩關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的病人的肩關(guān)節(jié)囊和皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)改

17、變的假設(shè)。本研究采用estern蛋白定量的方法，對(duì)關(guān)節(jié)囊I、型膠原進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在DDH組關(guān)節(jié)囊中I型膠原較正常組減少，而型膠原與正常組無明顯差異，并與RNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。I型膠原主要的生理功能為抵抗生物張力2，它的含量減少可能會(huì)導(dǎo)致抗張能力下降，關(guān)節(jié)松弛乃至脫位的發(fā)生。綜上所述，DDH患兒圓韌帶中I型膠原在RNA水平及蛋白水平表達(dá)的下降可能是導(dǎo)致關(guān)節(jié)松弛、進(jìn)而脫位的主要原因。分析其原因可能有：(1)激素影響：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中早在1976年Haa等發(fā)現(xiàn)卵巢切除大鼠髖關(guān)節(jié)囊的膠原含量及直徑明顯增加，應(yīng)用雌激素后再明顯減小，說明了雌激素對(duì)膠原合成的抑制作用。出生后雖然雌激素水平明顯降低，但靶器官的高

18、敏感性亦會(huì)使其受到激素影響，膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶中已被證實(shí)雌激素受體的存在8，同時(shí)交叉韌帶內(nèi)成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)也證實(shí)培養(yǎng)液雌激素濃度與成纖維細(xì)胞增殖和I型前膠原合成量成反比，而對(duì)型前膠原合成無明顯影響9。圓韌帶的成纖維細(xì)胞內(nèi)是否存在雌激素受體，胎兒在宮內(nèi)高雌激素環(huán)境下膠原代謝是否受到上述影響目前未見相關(guān)報(bào)道，值得進(jìn)一步探索。(2)合成與分解：細(xì)胞因子TGF-和(或)IGF家族成員會(huì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞I型膠原的合成。金屬蛋白酶(P)直接參與膠原的降解。另外一些小分子蛋白多糖(biglyan,derin，fibrulin等)也對(duì)膠原合成及粘集起重要作用10。目前尚不知上述物質(zhì)在DDH中對(duì)圓韌帶膠原代謝的

19、影響。(3)異常生物力學(xué)的影響：宮內(nèi)擁擠，臀先露胎位，髖關(guān)節(jié)脫位后的負(fù)重行走等都會(huì)對(duì)圓韌帶產(chǎn)生異常生物力學(xué)刺激，并可能由此轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)而影響膠原代謝。本研究尚不能區(qū)分膠原代謝異常與DDH的髖關(guān)節(jié)異常生物力學(xué)孰為因果，有待于進(jìn)一步深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1SteheliLT.Pratiefpediatrirthpedis.Sendedit.Philadelphia:Lippinttilliansilkins,2006，173-180.2BrdskyB,PersikvAV.leularstruturefthellagentriplehelixJ.AdvPrtEinhe,2005,70:301-339.3antyEG,KadlerKE.Prllagentraffiking,pressingandfibrillgenesisJ.JellSi,2005,118:1341-1353.4LiuSH,YangRS,al-ShaikhR,etal.llagenintendn,ligaent,andbnehealing.AurrentrevieJ.linrthpRelatRes,1995,318:265-278.5BlandYS,AshhurstDE.hangesinthententfthefibrillarllagensandtheexpressinftheirRN