核酸擴增技術在結核病診斷中的應用與進展

1、核酸擴增技術在結核病診斷中的應用與進展近10余年來現代分子生物學的迅猛開展，為臨床實驗室診斷提供了較為可靠的核酸檢測方法。經典聚合酶鏈反響(PR)擴增技術已廣泛應用于結核病的診斷；然而，由于污染問題嚴重，擴增抑制物的存在，試劑盒缺乏標準化、標準化，加之技術、條件、質控等方面因素影響，其敏感性、特異性差異頗大，人們對其可信度、可靠性產生了疑心，給臨床醫(yī)生診斷結核病帶來了一定的困惑。為此，國外學者開發(fā)出具有高度敏感性、特異性、標準化、商品化的PR擴增試劑盒；繼PR之后，又開展了幾種新的核酸體外擴增技術。現就其在結核病診斷方面的應用與進展作一介紹，供廣闊同道借鑒。一、PR為根底擴增反響即RheApl

2、ir結核分支桿菌PR試驗(AplirpR)AplirPR系應用生物素標記位于結核分支桿菌16SrRNA基因中高度保守區(qū)域種特異性引物擴增結核分支桿菌復合群DNA中584bp序列；生物素標記的擴增子(aplin)與種特異性DNA探針進展雜交后，應用標準酶聯免疫技術進展比色鑒定，結果判斷以450n波長時吸光度(A450)0.350為陽性標準13。AplirpR是由瑞士Rhe公司開發(fā)研制的標準化、商品化試劑盒，該試劑盒有三個不同的小盒：標本處理盒、擴增盒和鑒定盒。為防止穿插污染，廠商推薦試劑制備、標本處理、擴增與鑒定應三室分開，此外，應用尿嘧啶-N-糖基化酶控制擴增子攜帶污染。研究說明，Aplirp

3、R可檢出少至210個結核分支桿菌中DNA。與培養(yǎng)法相比，AplirpR檢測臨床標本中結核分支桿菌DNA的敏感性為76.7%97.8%，特異性達97.7%99.3%，陽性預計值(PPV)66%93%，陰性預計值(NPV)98%98.6%24，6。假設參考臨床綜合診斷，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為66.7%85.4%、99.6%100%、91.7%100%、96.8%98.6%，該方法至少與培養(yǎng)法一樣敏感1，46。對于涂陽標本，AplirpR敏感性(97.6%98%)顯著高于涂陰標本(40%53%)4，6。該方法還可對涂陽標本應用種特異性探針對結核分支桿菌和非結核分支桿菌(TT)早期進展

4、菌種鑒定2，4。AplirpR整個過程僅需7小時左右，用于檢測BATE培養(yǎng)基中結核分支桿菌較核酸探針雜交試驗提早4天以上4。法國學者arpentier等5對AplirpR進展多中心研究，結果顯示，其檢測肺外標本(尿、胸腹液、腦脊液等)、涂陽標本、涂陰標本及培陽標本的敏感性分別為83%、94.5%、74%、95%，特異性達98%。AplirpR不僅具有高度敏感性、特異性和可重復性，而且操作簡單，無需昂貴設備，無放射性污染問題；然而，其靈敏度較經典PR稍低，可能系標本量較少及存在抑制因子所致。AplirpR在方法學上仍需進一步自動化以防止手工重復操作。二、轉錄介導擴增反響即基因探針擴增直接試驗(A

5、TDT)ATDT是由美國加州Gen-Prbe公司開展起來的由DNA介導的等溫rRNA擴增法，擴增子應用吖啶酯(aridinuester,AE)標記的化學發(fā)光探針(AE-DNA探針)進展核酸雜交保護實驗(hybridizatinprtetinassay,HPA)，通過照度計檢測雜交探針的相對發(fā)光值(ralativelightunits,RLU)，以RLU3104判斷為陽性。該rRNA序列在核酸中存在2103拷貝數，應用ATDT可使特異性靶rRNA序列擴增109倍，其檢測低限為每l10個13。由該公司消費的商品化試劑盒應用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAL)和十二烷基硫酸鈉(SDS)對標本進展消化與去

6、污染處理，且該過程在單管中進展，這樣也防止了標本間可能的穿插污染；該試劑盒能直接用于各種臨床標本的檢測，整個過程僅需5小時便可完成。與培養(yǎng)法相比，ATDT檢測臨床標本敏感性為92.9%100%，特異性為90.1%98.7%；結合臨床綜合判斷，ATDT敏感性、特異性、PPV、NPV分別達83.9%100%、97.6%100%、80.7%100%、96.3%99.3，其敏感性與培養(yǎng)法相等或稍高13，7，9。研究說明，ATDT檢測肺外標本(胸腹液，腦脊液)的敏感性和特異性與肺部標本大致相仿(P0.05)，并不低于培養(yǎng)法；把標本量從50l增加到500l，然后進展離心，可明顯進步該試驗結果的敏感性，而不

7、影響其特異性7，8。日本學者Abe等10比擬了經典PR和ATDT檢測痰標本結果，發(fā)現ATDT檢測總陽性率達91.9%，高于經典PR法(84.2%)。ATDT檢測未經抗結核治療臨床標本的敏感性高于抗結核治療者，即隨著化療的進展，象涂片和培養(yǎng)一樣ATDT逐漸陰轉，然而，有少數患者持續(xù)陽性，考慮可能系死菌核糖體蛋白保護了16SrRNA，而使ATDT能檢測出無力菌中的rRNA，因此，該方法不能用于監(jiān)測化療效果7。由于ATDT不能鑒別結核分支桿菌和TT，也不能進展藥敏試驗，因此不能代替?zhèn)鹘y的培養(yǎng)法8。三、連接酶鏈反響(ligasehainreatin,LR)DNA連接酶具有將兩條DNA單鏈連接在一起并與

8、互補鏈結合的功能。1991年，Barany利用穩(wěn)定Taq連接酶，借助PR原理，首先建立了LR；此后，美國芝加哥Abbtt實驗室開發(fā)出半自動商品化LR診斷試劑盒(Abbttlx)11，12。LR擴增的靶序列位于編碼蛋白抗原b的染色體基因中，該基因為結核分支桿菌復合群所特有。在Lx擴增體系中，成對設計的四條寡核苷酸探針識別并與之互補的單鏈結核分支桿菌靶序列(標本制備所暴露的)進展雜交，每對寡核苷酸探針均應用不同半抗原進展標記，一條含有捕獲半抗原，用于捕獲靶序列；另一條含有檢測半抗原，為了檢測。當一對探針與DNA一條單鏈上蛋白抗原b基因靶序列雜交時，在探針之間有幾個寡核苷酸的縫隙，聚合酶在寡核苷酸充

9、填這個縫隙起作用，一旦縫隙被充填，連接酶能共價地連接這對探針形成擴增產物，這樣，擴增產物的一端含有了捕獲半抗原，而另一端那么含有檢測半抗原，該產物與原有靶序列互補，其本身又可做為下一次擴增循環(huán)的靶源，如此往復，靶序列呈指數性增長1113。擴增反響在Lx熱循環(huán)儀中進展，941秒，641秒，6940秒，共37個循環(huán)；LR擴增產物在Abbttlx分析儀上通過微粒酶聯免疫測定法進展檢測，以樣本熒光率/分界值(標準熒光率0.30)(S/)1.0為陽性標準。Lx可直接用于臨床標本的檢測；對臨床確診的結核患者，其檢測呼吸道標本的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為90.8%98.97%、98.97%100%

10、、96.96%100%、94.7%99.62%；檢測肺外標本之敏感性、特異性、PPV、NPV分別為73.33%、100%、100%、97.06%；其敏感性(89.36%90.8%)較培養(yǎng)法(82.9%88.2%)和涂片法(78.72%)均高11，12。晚近，挪威學者Lindbrathen等13應用LR檢測482份臨床標本，與培養(yǎng)相比，其檢測涂陽標本、涂陰標本的敏感性分別為96.7%、72%；結合臨床綜合判斷，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為90.7%、99.2%、97.4%、96.7%；此外，14份TT培養(yǎng)陽性標本LR均為陰性，其中包括2份海魚和潰瘍分支桿菌培養(yǎng)陽性的標本，提示LR對結核

11、分支桿菌復合群最具特異性。LR具有以下特點：(1)快速：5小時內可出結果；(2)檢測呼吸道和非呼吸道標本均具有高度敏感性和特異性；(3)可進展分支桿菌菌型鑒定：涂片陽性而LR陰性那么提示為TT感染，不必等待培養(yǎng)結果；(4)污染少：該擴增系統是完全密閉的，因此，不存在穿插污染或攜帶污染；(5)LR可檢出無活力菌中DNA，因此，不合適于化療的隨訪；(6)LR要求整個靶序列必須，一個核苷酸的錯配，可阻止兩條單鏈的連接，因此，LR可準確檢測基因序列中單個基因突變。四、鏈替代擴增反響(stranddisplaeentaplifiatin,SDA)SDA是一種新的等溫體外DNA擴增方法，1992年由美國學

12、者alker等14首先建立，根本原理如下：靶DNA序列經加熱變性后，引物與其對應DNA單鏈雜交(退火)，在聚合酶作用下產生帶Hin識別位點含5和3末端的靶DNA序列，該靶序列進入SDA循環(huán)。首先由Hin限制性核酸內切酶切割識別位點，依賴DNA聚合酶在切割處延伸3端，并替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又依次做為另一擴增反響的靶源，這些步驟在反響體系中不斷重復，使靶DNA序列呈指數性增長；374023次循環(huán)后，2小時內靶序列可得到108擴增。擴增產物經生物素標記DNA探針雜交后應用化學發(fā)光酶聯免疫試驗進展檢測，其檢測純化DNA低限為550個基因拷貝數15。1994年，alker等15進一步

13、對SDA進展了改進，應用SDA同時擴增兩個靶DNA序列(16SrDNA序列和IS6110序列)和一個內對照靶序列，即復合SDA(SDA)系統，通過接合器(adapter)介導在不同靶序列末端連接上共同引物序列，這樣一對引物便擴增了不同靶序列，從而，有助于鑒別結核分支桿菌和TT。Badak等16應用SDA檢測分支桿菌生長指示試管(GIT)培養(yǎng)系統中結核分支桿菌和TT，敏感性為97.2%，特異性96.1%。有作者應用SDA擴增IS6110序列檢測294份痰標本，敏感性達95%100%，特異性為84%98%17。日本Ihiyaa等18對半自動BDPrbeTe-SDA系統和AplirpR檢測痰標本中分

14、支桿菌進展了比擬，結果顯示，SDA和AplirpR檢測結核分支桿菌培養(yǎng)陽性標本之敏感性分別為94.7%和89.5%，特異性分別為99.8%和100%；29份鳥復合型分支桿菌(A)培養(yǎng)陽性標本中，SDA陽性24份(敏感性82.8%)，AplirpR陽性23份(敏感性79.3%)，特異性分別為98.3%和100%；該SDA系統可同時擴增48份臨床標本，且整個過程僅需6小時。SDA和PR一樣受共同實驗條件和參數如靶序列長度、靶序列dGd含量、引物序列、細菌裂解技術等的影響，因此，也給該擴增技術帶來了一定的局限性。五、QB復制酶擴增法QB復制酶是源于QB噬菌體中的RNA依賴的RNA聚合酶，該酶具有復制

15、限制性RNA分子的作用。1994年，美國學者Shah等首先建立QB復制酶擴增法，接著用于檢測結核分支桿菌的研究19。其根本原理如下：首先合成兩條單鏈與結核分支桿菌23SrRNA5區(qū)域一樣靶序列互補的捕獲探針A和B，設計一條含有與23SrRNA一個區(qū)域互相補的檢測探針；在擴增前應用可逆性靶捕獲技術(RT)去除標本基質中可能的抑制因子，降低TT非特異性競爭作用，進步擴增的特異性。RT的詳細步驟如下：首先捕獲探針A、檢測探針與靶序列進展雜交，形成的三重雜交子被一含有反配體的順磁性顆粒所捕獲，經洗脫后釋放出檢測探針-靶雜交子；該雜交子又與捕獲探針B進展雜交，所形成的捕獲探針B-檢測探針-靶三重雜交子被

16、另一順磁性顆粒捕獲、洗脫后重新被釋放，接著，該三重雜交子再連續(xù)地經過兩次捕獲、洗脫過程，最終釋放出的檢測探針-靶雜交子或檢測探針經QB復制酶擴增后呈指數性增長，在36.5小時內靶RNA序列可得到109擴增。擴增產物應用熒光計進展檢測；該方法可檢出103純化結核分支桿菌rRNA，相當于每反響管1FU，檢測痰標本低限為10100FU/5l1921。Shah等20應用手工QB復制酶擴增法檢測臨床標本，與培養(yǎng)法相比，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為97.1%、96.5%、80.5%、99.5%；根據臨床確診結果，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為97.3%、97.8%、87.8%、99.5%

17、，敏感性高于培養(yǎng)法(91.9%)。最近，美國Gene-Trak公司制造出全自動QB復制酶擴增包裝試劑盒；Sith等21，22應用該試劑盒檢測冷凍痰標本，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為79%、98%、97%、85%；同時對780份臨床呼吸道標本(痰、BALF)進展了檢測，其敏感性為84%，特異性達97%。QB復制酶擴增法具有以下優(yōu)點：(1)快速：36.5小時可得結果；(2)特異性強：僅結核分支桿菌rRNA擴增反響陽性，而TT和其它細菌RNA均得不到擴增；(3)結果不受標本中抑制劑的影響：痰或其它臨床標本在擴增前經RT技術使探針-靶序列得到高度純化，4個循環(huán)后，可使抑制劑降低1012101

18、6倍；這樣，在擴增時可允許多量標本進展檢測，因此，QB復制酶擴增法更合適于檢測涂陰培陽標本。由于該方法所擴增的模板為23SrRNA，其在死菌中同樣可能受到核糖體蛋白的保護而穩(wěn)定一段時間，因此，QB復制酶擴增法能否用于化療效果的監(jiān)測仍有待進一步討論。六、結語與展望綜上所述，核酸擴增技術以其敏感、特異、快速、簡便向人們充分展示了其在結核病臨床診斷中的宏大優(yōu)越性。AplirpR和ATDT已在國外臨床微生物學實驗室普遍開展應用，并獲得了令人滿意的效果。由PR衍生的幾種新的分子診斷技術(LR、SDA、QB復制酶擴增法等)正逐步由實驗室過渡到臨床。核酸擴增技術是一種新興的開展中的診斷技術，在不少方面仍有待

19、改進與完善，如方法學上進一步自動化、簡單化，優(yōu)化實驗條件與參數，不斷改進檢測手段，拓寬應用范圍(分支桿菌菌型鑒定、藥敏試驗、化療效果的監(jiān)測等)，開發(fā)更為實用的標準化試劑盒等。隨著分子生物學的不斷開展，相信該技術不久將成為診斷結核病的常規(guī)方法。參考文獻2IhiyaaS,NuaY,TaadaY,etal.EvaluatinfGen-PrbeaplifiedybateriutuberulsisdirettestandRhePR-irellplatehybridizatinethd(Aplirybateriu)frdiretdetetinfybateria.Jlinirbil,1996,34:130-

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