高通量測序原理

1、高通量測序原理第1頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四Solexa技術(shù)介紹Solexa 技術(shù)最早由兩位劍橋大學的化學家創(chuàng)立，利用專利核心技術(shù)“DNA 簇” 和“可逆性末端終結(jié)”，達成自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。第2頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四Solexa 的基本原理第3頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四擴增“橋”結(jié)構(gòu)單鏈引物第4頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四DNA簇第5頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四單分子克隆1000 DNA片段per 1 m

2、 “DNA簇” 1000 “DNA簇” per 100 m square40 million clusters per experiment準備DNA片段兩端接上 adapters將DNA片段通過adapter錨定在芯片上循環(huán)擴增DNA片段成“DNA簇”20 micronsSequence第6頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四檢測第7頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四可逆終止反應Reversible Terminator ChemistryO PPPHNNOO熒光基團3保護基團Next cycle摻入檢測去保護基團 去熒光基團ODNAHNNOO3

3、O5游離3末端XOH4種標記過的核苷酸第8頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四Sequencing-by-Synthesis (SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTA摻入一個堿基Cycle 1: 加入反應體系移除其他未摻入的核苷酸信號檢測Cycle 2-n: 加入反應體系，循環(huán)cycle 11、每輪測序反應加入四種帶有熒光標記的dNTP，末端帶有可以被去除的保護基團2、每輪反應只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應的熒光信號3、信號讀取結(jié)束，用化學方法去除阻斷基團和熒光基團，進行下一輪測序反應第9頁，共14頁，2022年，5月20日，18

4、點30分，星期四第10頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 根據(jù)每個DNA簇每輪反應讀取的熒光信號序列，轉(zhuǎn)換成相應的DNA序列通過熒光信號分析核苷酸序列第11頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四優(yōu)缺點高度自動化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進行大量小片段的測序，如microRNA profiling基于可逆反應，隨反應輪數(shù)增加，效率降低，信號衰減，讀取序列較短，給從頭測序（de novo sequencing） 拼接帶來困難第12頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四技術(shù)特色突出表現(xiàn)每張測序芯片有8 個通道，每個通道可單獨運行一個樣品，也可以把多個樣品混合在一起檢測；一次實驗可讀取大于15 億個堿基/芯片；無需建庫，自動化樣品制備，簡單；實驗費用低，測序成本為傳統(tǒng)測序方法的1/100；樣本使用效率極高，所以對少量樣本也可以極靈敏精確地檢測。第13頁，共14頁，2022年，5月20日，18點30分，星期四