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文檔簡介

1、2022/9/11蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院 葉亞新第二章 基因克隆所需的工具酶 限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 其它酶類-用于生物細(xì)胞的破壁,轉(zhuǎn)化,核酸純化,檢測等2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新第二章 基因克隆所需的工具酶 第一節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu)DNA的組成DNA的空間結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制起始點和復(fù)制子的結(jié)構(gòu)DNA轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物

2、系 葉亞新Chemical structures of the pyrimidines and purines that serve as the nitrogenous bases in RNA and DNA (b)Chemical ring structures of ribose and 2-deoxyribose, which serve as the pentose sugars in RNA and DNA respectively. 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新Structures and names of the nucleosides and nucleot

3、ides of RNA and DNA.2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新Linkage of two nucleotides by the formation of a C-3C-5 (3-5) phosphodiester bond, producing a dinucleotide. (b) Shorthand notation for a polynucleotide chain. 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新The top half of the figure shows computer-generated space-filling models of

4、B-DNA, A-DNA, and Z-DNA.2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新天然DNA的來源染色體DNA、病毒和噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、線粒體和葉綠體DNA天然DNA的提取準(zhǔn)備生物材料裂解細(xì)胞分離和抽提DNA第二節(jié) 天然DNA的制備2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶一 . 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1.細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) Werner Arber于1962-1968年發(fā)現(xiàn),

5、1968年分離到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的發(fā)現(xiàn) HOSmith 和Wilox 于1970年首次從流感嗜血桿菌(H. influenzae)中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 D. Nathans(1971年)用HindII繪制SV40的限制酶譜。 第三節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片斷化2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新1.I型:由三個基因構(gòu)成,hsdR;hsdM;hsdS(host specificity for DNA restriction modification and specificity)位于染色體上,三個基因構(gòu)成

6、一個復(fù)合體,限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(腺苷甲硫氨酸)。2.II型:限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用,在. coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.III型:修飾酶與型酶相同,hsd與hsd基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位,限制酶是獨立存在的。 上述三個系統(tǒng)中,只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性,因而被廣泛用于基因工程中。 二、限制修飾系統(tǒng)的種類2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新)平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 )非互補的粘性末端 )切點在識別順序之外的,如:FokI Fok I 5-GGATG

7、()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 )能識別簡并順序的,如:AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG四限制酶的特點2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 1. 定義:能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶 2. 特點:1)識別相同順序 2)切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG五. 異源同序酶(isoschizomer,同裂酶)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新限制性核

8、酸內(nèi)切酶作用機制2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、限制性核酸內(nèi)切酶作用機制The restriction enzyme EcoRI recognizes and binds to the palindromic nucleotide sequence GAATTC. 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新6、限制性內(nèi)切酶的星號活性引起星號活性的可能因素甘油濃度過高離子強度不合適陽離子的變化溶液中PH值的變化在基因工程操作中,應(yīng)避免星號反應(yīng)的出現(xiàn)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、限制酶的使用方法用限制酶消化DNA(酶切)是基因工程最基本的實驗技術(shù)最常用的消化條件

9、:反應(yīng)體積:20ul10 xBuffer:2ulDNA濃度:0.51.0ul2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、限制酶的使用方法1、影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的純度的影響DNA濃度的影響酶濃度的影響酶反應(yīng)條件的影響雙酶消化2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的純度的影響限制酶作用于純度不高的DNA時,會進行不完全酶解(部分酶切)RNA或其他DNA的污染影響小蛋白質(zhì)污染并與DNA結(jié)合后,可能降低或終止酶切反應(yīng)解決辦法:用酚和氯仿抽提除去蛋白質(zhì)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的濃度的影

10、響DNA濃度過高帶進更多的雜酶和雜質(zhì)如限制酶量不足,可能引起部分酶切底物濃度過高,可能引起底物抑制2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素酶濃度的影響1 酶單位:是指在最適條件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量過多,帶進的雜質(zhì)愈多,有可能增加Dnase 1的危險酶切設(shè)計時,甘油濃度不要超過52022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素酶反應(yīng)條件的影響一般酶的反應(yīng)條件:溫度:37 PH:7.2 時間:2小時DNA酶切反應(yīng)(控制反應(yīng)時間)完全消化部分消化2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新影響限制酶消化DNA的若

11、干因素雙酶消化反應(yīng)條件相同:同時加到反應(yīng)管,同時反應(yīng)對溫度要求不同:先低溫消化,再高溫消化對鹽濃度要求不同:先低鹽酶消化,再高鹽酶消化2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、限制酶的使用方法2、單一限制酶酶切位點的創(chuàng)立 利用甲基化酶的修飾作用改變酶的識別序列,創(chuàng)造新的識別位點消除反應(yīng):某一種限制酶存在兩種識別序列,如將其中一個序列中的某個堿基甲基化,使其不能被限制酶識別,從而使另一序列成為單一酶切位點鄰近反應(yīng):與限制酶識別序列鄰近的堿基有時作為某個甲基化酶的識別序列,而使其不再被限制酶所識別如BamH 1 :GGATCC GGATCCGG2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新構(gòu)建

12、DNA的物理圖譜構(gòu)建物理圖譜的常用方法部分消化法基本原理:首先以某個酶對DNA進行完全消化,再進行部分消化: 部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相應(yīng)部位的2個以上小片段之和。根據(jù)兩類消化中片段大小的關(guān)系和交錯重疊現(xiàn)象找出各片段的鄰近位置,排出它們的順序。 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新某限制酶在一線型DNA分子上有三個切點:完全消化:A, B, C, D部分消化:BC, AD, ABC, D, ACD, B, AC, A, C推測其物理圖譜。提示:從部分消化的結(jié)果中排除與完全消化相同的單一片段,然后根據(jù)剩余片段,推測其物理圖譜從部分消化的結(jié)果中排除與完全消化相同的單一片段剩

13、余:BC, AD, ABC, ACD, AC推測其物理圖譜為:BCAD2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新從細(xì)菌中分離了一個18.1Kb的線形DNA,用Ava完全消化得到8個片段,部分消化產(chǎn)生14個片段,求其物理圖譜。完全消化片段:A (4.6), B (4.0), C (3.3), D (2.5), E (2.0), F (1.0), G (0.5), H (0.2)從部分消化的結(jié)果中排除與完全消化相同的單一片段剩余:6.6, 6.5, 5.3, 4.2, 3.8, 3.5, 0.7部分消化片段:6.6, 6.5, 5.3, 4.6, 4.2, 4.0, 3.8, 3.5, 3.3,

14、 2.5, 1.0, 0.7, 0.5, 0.22022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新構(gòu)建DNA的物理圖譜構(gòu)建物理圖譜的常用方法雙酶消化法兩個限制性內(nèi)切酶先分別單獨消化DNA的基礎(chǔ)上,然后再同時或先后消化此DNA基本原理:單酶消化時的某些片段在雙酶消化時可能仍然保留,另一些片斷可能消失而出現(xiàn)新的片段,說明一個酶的切點 可能正好在另一個酶的片段之內(nèi)。那么,新出現(xiàn)的2或3個片段的分子量之和必然等于那個消失的大片段:根據(jù)片段的大小找出消失片段與新生片段的關(guān)系,通過它們的交錯重疊現(xiàn)象確定各片段間的鄰近位置,組建出此DNA的物理圖譜。 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新用雙酶消化法組建某

15、線型DNA的物理圖譜用甲酶單獨消化產(chǎn)生兩個片段a , b用乙酶單獨消化得到三個片段A , B , C用甲酶、乙酶混合消化得到四個片段:A, 1 , 2 , C試分析其相互關(guān)系。a b甲酶A B C乙酶A 1 2 C乙酶乙酶甲酶2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新從大腸桿菌分離到一個質(zhì)粒DNA,用EcoRI,Hinc ,HpaI,SmaI進行單一和雙酶消化,組建它們的物理圖譜 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 根據(jù)片段的大小,將每一對酶的結(jié)果分別清理,除去在單酶和雙酶消化時共同產(chǎn)生的片段,再按照分子量大小,找出新生小片段和一個消失大片段之間的關(guān)系 2022/9/11蘇州科技學(xué)

16、院生物系 葉亞新第四節(jié) 其他工具酶一、E.coli DNA聚合酶(DNA pol )E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng)Pol I 參與DNA修復(fù), 具35和53外切酶活性pol II 同上 具35外切酶活性pol III 參與DNA復(fù)制,具35和53外切酶活性E.coli pol I的特點具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性,在蛋白酶作用下,該酶分裂成兩個大小不同的片段,其中小片段具53外切酶活性,大片段具35外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段, polIK)聚合酶活性,53, 要求3-OH引物和模板DNA,其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響(表6) 外切酶活性 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系

17、葉亞新一、E.coli DNA聚合酶(DNA pol )5-3聚合酶活性催化單核甘酸結(jié)合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ GGCTATCGGA2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新一、E.coli DNA聚合酶(DNA pol )3-5外切酶活性 從游離的3OH末端降解dsDNA成為單核甘酸,但是它解離掉的部分主要是未配對的ssDNA. (其對dsDNA的外切活性可被53多聚活性所抑制)5CCGTATCGGAOH DNApol 1 5CCG GGC Mg2+ GGC2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新一、E

18、.coli DNA聚合酶(DNA pol )5-3外切酶活性 從5末端降解dsDNA成為單核甘酸, 5 GATAGCCT DNApol 1 5 TAGCCT 3 GGCTATCGGA Mg2+ 3 GGCTATCGGA 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新E.coli DNA pol 在基因工程中的作用制備高比活的DNA探針(采用缺口平移技術(shù))用于分子克隆DNA序列分析2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、DNA聚合酶大片斷(Klenow酶)5-3聚合酶活性催化單核甘酸結(jié)合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 1 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA M

19、g2+ GGCTATCGGA2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、DNA聚合酶大片斷(Klenow酶)3-5外切酶活性 作用底物主要是ssDNA. (其對dsDNA的外切活性由于受到聚合酶作用的阻礙大大降低)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、DNA聚合酶大片斷(Klenow酶)在基因工程中的作用用同位素標(biāo)記DNA片斷的3末端 當(dāng)DNA經(jīng)限制酶酶切產(chǎn)生5端伸出的末端時,可用Klenow酶催化,在3端標(biāo)記上與5端伸出的堿基順序互補的核甘酸,在此反應(yīng)中應(yīng)用的同位素必須是32P-dNTP2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新C T T A A 5G32P-dATPC T

20、T A A 5G A *A*Klenow酶C T T A A 5G32P-dATP32P-dTTPC T T A A 5G A *A* T * T * Klenow酶2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新二、DNA聚合酶大片斷(Klenow酶)在基因工程中的作用用同位素標(biāo)記DNA片斷的3末端用Klenow酶可將5端伸出的末端填平為平末端在反向轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 的實驗中,用Klenow酶合成雙鏈 cDNA,除去3端的單鏈末端 2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新三、T4 DNA 連接酶缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口

21、, 缺口, 斷口2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新三、T4 DNA 連接酶1. 特點:只連接ds -DNA分子,要求3-羥基和5-磷酸基 2. 用途: 1) 相同或相容粘性末端的連接 2) 平整末端的相連 DNA平端來源:限制酶作用結(jié)果; 限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多,所需的酶量也多3. 抑制劑: PO43-5mM , NaCl25mM, Ca+0.1mM2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火

22、 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA連接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 T4 DNA連接酶的連接反應(yīng)(兩種插入方向) +2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新四、逆轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA的DNA聚合酶) 一種有效轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶,產(chǎn)物為

23、cDNA,(互補DNA)由兩種亞基組成,帶有聚合酶活性和外切酶活性。聚合酶作用以RNA和DNA 為模板,合成DNA mRNAcDNA , sscDNAdscDNA.2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新四、逆轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA的DNA聚合酶)3外切核酸酶作用(RNase H) 從DNA.RNA的雜交鏈中特異性地降解RNA鏈,進而保留新合成的DNA鏈在基因工程中的作用用mRNA為模板合成單鏈cDNA,或以單鏈cDNA合成雙鏈cDNA(制備cDNA庫的常用方法)制備各種分子雜交的探針,用于檢測DNA或RNA2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新五、核酸酶S I(單鏈特異的核酸酶)降解s

24、sDNA或ssRNA形成5磷酸末端的單核甘酸或寡核甘酸片斷。在基因工程中的作用證明基因內(nèi)部的間隔順序在cDNA合成中切開cDNA雙鏈的發(fā)夾構(gòu)建新的質(zhì)粒使用注意事項 1) 避免長時間反應(yīng),因最適酸性pH將導(dǎo)致DNA斷裂或降解 2) 避免使用高濃度酶量,以免DNA被降解(因產(chǎn)生切口)2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)5555552022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新六、甲基化酶一. 甲基化酶的種類與識別順序 1. 限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶 三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化,形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤: 在DNA重組實驗中,常用的甲基化酶屬于II型,它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同,其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如:M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同2022/9/11蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新

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