布氏鏡檢查丁酸鈉阻礙HT

1、布氏鏡檢查丁酸鈉阻礙HT劉成霞張尚忠劉宗印 黃麗華張孝衛(wèi)【關(guān)鍵詞】多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) ；丁酸鈉； HT【摘要】 目的 觀看丁酸鈉對結(jié)腸癌 HT細胞形態(tài)和生物學(xué)特性的阻礙。方式 多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) 動態(tài)觀看丁酸鈉作用前后 HT細胞的生長狀態(tài)、細胞運動及貼壁進程的轉(zhuǎn)變。結(jié)果 丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后， HT細胞數(shù)量明顯減少，細胞巢變小，巢內(nèi)細胞數(shù)減少； 細胞變成圓形 ，細胞大小趨于一致； 細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細胞形態(tài)；貼壁進程明顯變緩。結(jié)論 丁酸鈉能夠改變 HT的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡能夠動態(tài)地觀看藥物作用前后培育細

2、胞的形態(tài)、微細結(jié)構(gòu)及運動的轉(zhuǎn)變，是一項先進的、具有有效價值的檢查技術(shù)。【關(guān)鍵詞】多功能透射顯微鏡 ( 布氏鏡 ) ；丁酸鈉； HT細胞株【 bstract】 bjective To investigate the effect ofsodium butyrate on theappearance and bionomics ofcolon cancerline HT ethodsViewing theeffect ofsodium butyrate ondifferences of the growth,as well as the cell movement,and theadherence

3、 procedure ofHT withbradfordvariableprojectivemicroscopy (BVPM). esultsfter 24 hours of coincubation ofHTand sodium butyrate (5mmol/L),it was showed that theamount of HT decreased,the cell nests shrank,and the cellpopulation of each cellnestdiminished;mostofthe HT29 changedintoglobular,andthebulkofH

4、Tlookedwelldistibuted;chromatingathereduneven,andtherefractionweaken,many ofthemlooked asapoptosiscells;adherenceprocedure of HT stepped down obviously.onclusion Sodiumbutyrate may inhibit HT growth and monitoring the changesof cultured consecutively technique.cells in cytomorph ，fine structure and

5、its movement with BVPMis an advanced and practical examination【 eywords】 brafordvariableprojectivemicroscopy(BVPM), sodium butyrate,cell line對腫瘤細胞進行體外培育，同時給予藥物干與是目前研究和挑選抗腫瘤藥物的要緊方式之一。但關(guān)于藥物對培育的活體腫瘤細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的動態(tài)轉(zhuǎn)變研究尚未見報導(dǎo)。本研究應(yīng)用布氏鏡對丁酸鈉作用前后HT細胞形態(tài)和微細結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變進行動態(tài)圖像掃描與分析，清楚地觀看到 HT細胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)行為的動態(tài)轉(zhuǎn)變和丁酸鈉對腫瘤細胞的阻礙。材料和方式

6、1 布 氏 鏡 (bradfordvariableprojectivemicroscopy,BVPM, 可變投射顯微鏡的簡稱)BVPM型，美國生物公司生產(chǎn)。 細胞株結(jié)腸癌 HT細胞株， 購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。 藥物和標本制備1 丁酸鈉 (Sodium Butyrate): 購于 Sigma 公司，用PBS配制成 01 mol/L 的貯存液， 4 保留備用。臨用前用培育液稀釋成實驗所需濃度。132 細胞培育方式和標本制備：將15 mm15 mm大小的蓋玻片常常規(guī)泡酸、清洗、高壓消毒處置后備用。結(jié)腸癌HT細胞培育于含 10%小牛血清 ( 杭州四季青生物制品公司) 的 RPMI1640(Hyclon

7、e),在 37、5%的 CO、飽和濕度的培育箱中培育。 取對數(shù)生長期的細胞，用 025%的胰蛋白酶消化，用含 10%小牛血清的 RPMI1640培育液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為 5 ml。將細胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培育皿中，每孔接種 6 ml 。置 37 、 5%CO恒溫培育箱中培育 3 d ，待細胞接近長成單層，改換培育液，加入丁酸鈉，使終濃度為 5 mmol/L，對照組加入等量的 PBS。經(jīng)丁酸鈉作用 24 h 后，終止培育。掏出蓋玻片，布氏鏡觀看。結(jié)果2 丁酸鈉對 HT細胞生長狀態(tài)的阻礙常規(guī)培育 24 h觀看，處于對數(shù)生長期的HT細胞呈巢狀生長，巢內(nèi)細胞密集，細胞間連接緊密，細胞界

8、限不清。細胞巢較大，多見80個細胞組成的大細胞巢。巢內(nèi)細胞呈梭形或長圓形，細胞大小差異，可見處于不同割裂期的細胞及雙核、多核細胞，細胞表現(xiàn)出活躍的生物學(xué)狀態(tài)。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后觀看，細胞明顯減少，細胞巢變小，巢內(nèi)細胞數(shù)多在 20，巢內(nèi)細胞松散，單個細胞界限清楚。視野內(nèi)幾乎見不到梭形細胞，細胞變成圓形，細胞大小趨于一致。 丁酸鈉對 HT細胞形態(tài)的阻礙 正常培育 24 h 觀看，處于對數(shù)生長期的 HT細胞核大，核漿比例可達 1，部份細胞表現(xiàn)為核漿比例倒置。細胞核形狀、大小不一，核仁清楚，核內(nèi)染色質(zhì)豐碩，積聚于核膜周圍。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后觀看，細胞

9、核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細胞形態(tài)。正常培育的 HT細胞膜表現(xiàn)為明顯的不規(guī)那么性， 細胞呈不定形。 每一個細胞可見 20個胞質(zhì)突起，呈指狀、球狀或不規(guī)那么形，可見偽足的形成及迅速變形，形態(tài)多樣、多變。丁酸鈉5 mmol/L 作用24 h 后動態(tài)觀看，每一個細胞可見3個球狀突起，轉(zhuǎn)變緩慢。 丁酸鈉對 HT細胞貼壁運動的阻礙取經(jīng)胰酶消化的正常 HT單細胞懸液，滴于載玻片上，再加蓋玻片后當即觀看。腫瘤細胞在貼壁生長的進程中胞漿豐碩，呈流動性，細胞原生質(zhì)伸展和收縮，使細胞伸出偽足，細胞變形，以阿米巴樣運動完成貼壁事后繼續(xù)生長。布氏鏡 6000 倍距離 1 min 持續(xù)記錄下的 HT細

10、胞的貼壁進程，可見細胞貼壁迅速。丁酸鈉 5 mmol/L 作用 24 h 后，觀看 HT 細胞的胞漿流動性減慢，偽足、突起較少，貼壁進程明顯變緩。討論腫瘤細胞的生物學(xué)特性與腫瘤細胞的運動緊密相關(guān)。細胞的運動，第一是伸出胞質(zhì)突， 胞漿隨之進入胞質(zhì)突， 形成阿米巴樣運動。在體內(nèi)，當腫瘤細胞離開原發(fā)灶后，必需借助本身的阿米巴樣運動侵入細胞外基質(zhì)，進而侵入繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤，完成體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的進程。體內(nèi)腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的運動性增強有關(guān)。而體外培育細胞的運動那么表此刻細胞貼壁和生長進程中， 細胞膜的迅速轉(zhuǎn)變，細胞漿的快速流動預(yù)示著細胞的生長代謝活躍。丁酸鈉是一種組蛋白去乙酰基酶抑制劑，它

11、通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄，增進細胞分化，抑制腫瘤細胞的生長。由于其具有毒性小、抗腫瘤作用好的特點，最近幾年來被普遍用于白血病、胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤的研究 。本研究發(fā)覺， 丁酸鈉能夠抑制HT29細胞的運輸能力，減弱其胞漿流動，從而抑制HT29的貼壁進程，丁酸鈉作用后，HT細胞形態(tài)變圓，細胞膜突起變少，細胞異型性減輕，細胞割裂減慢，明顯阻礙細胞的生長狀態(tài)。另外，由于用藥前細胞割裂活躍，處于割裂期的大細胞較多，細胞大小差異，致使細胞平均體積較大。丁酸鈉作用后，細胞大小趨于一致，細胞平均體積較用藥前減少約1，與李春蕊等6研究結(jié)果一致?？紤]可能與丁酸鈉

12、誘導(dǎo)p21WAF1等細胞周期調(diào)控基因的表達有關(guān)。但李豐等7在一般光鏡下觀看了丁酸鈉對低分化人結(jié)腸癌Clone2A 細胞形態(tài)的阻礙，發(fā)覺經(jīng)2 mmol/L丁酸鈉處置 4 d 后，細胞變長，并伸出較長的突起，趨向于成纖維細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。為何不同細胞對丁酸鈉表現(xiàn)不同的反映，機制不清，推測不同細胞株對藥物的靈敏性不同，也可能與丁酸鈉的濃度和作歷時刻有關(guān)。觀看藥物作用前后腫瘤細胞的轉(zhuǎn)變是體外評判藥物抗癌成效的重要指標。一般光學(xué)顯微鏡只能觀看固定在載玻片上的細胞，不能進行動態(tài)觀看；倒置顯微鏡盡管能夠觀看到培育細胞的生長狀態(tài)，但因其放大倍數(shù)有限 ( 一樣放大倍數(shù)為40倍 ) ，不能清楚的觀看活細胞的微細結(jié)構(gòu)和

13、細胞的運動狀態(tài)。電子顯微鏡在觀看細胞的超微結(jié)構(gòu)方面具有其他顯微鏡無可比擬的優(yōu)勢，但不能對活細胞進行觀看，且標本制作費時、 復(fù)雜。布氏鏡具有 40 0 倍的持續(xù)調(diào)劑功能，同時具有相差、暗視野、微分干與分析、中密度及偏振光等多種功能，應(yīng)用布氏鏡對體外培育的細胞進行動態(tài)圖像掃描，能清楚、直觀地觀看到活細胞的微細結(jié)構(gòu)和動態(tài)轉(zhuǎn)變。 通過丁酸鈉作用前后 HT29 細胞的轉(zhuǎn)變，能夠更直觀地觀看丁酸鈉對 HT細胞生物學(xué)行為的阻礙。檢查只需將細胞培育在蓋玻片上，或?qū)⒓毎麘乙褐苯拥斡谳d玻片上直接觀看，無需固定、染色等處置，方式簡便，圖像直觀。本研究發(fā)覺， HT呈巢狀生長， 細胞割裂旺盛、 運動增強、貼壁進程迅速，

14、 呈現(xiàn)十分活躍的生物學(xué)特性； 丁酸鈉能夠改變 HT的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡能夠動態(tài)地觀看藥物作用前后細胞形態(tài)、微細結(jié)構(gòu)及運動的轉(zhuǎn)變，是一項先進的、具有有效價值的檢查技術(shù)。參考文獻陳意生，史景泉腫瘤分子細胞生物學(xué)北京：人民軍醫(yī)出版社， 2002 illenwater A,Zou CP,Zhong M， et of sodiumbutyrate on growth,differentiation,and apoptosis in head andnecksquamouscarcinomacelllineseadNeck,2000,22(3):247new strategyeidle U,Grossmann of histone deacetylases:ato targetepigeneticmodificationsforanticancertreatment nticancer Res,2000,20(3A):1471itvakDA,HwangKO,Evers BM,et ofapoptosisinhuman gastriccancerby sodium butyrate nticancerRes,2000,20(2A):779 noue H,Shiraki K,Ohmori S,et deacetylase inhibitors sensitiz