microRNA 過表達(dá)載體具體步驟及說明

1、microRNA過表達(dá)載體具體使用說明及步驟MicroRNA ( miRNA )是一類真核生物內(nèi)源性 的小分子單鏈RNA，通常長為1825nt，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結(jié)合，引起靶序列降解或抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào) 控(如右圖所示)。 GenePharmaMicroRNA 載體 利用 CMV 啟動子可以在眾多哺乳動物細(xì)胞中快速、 高效、持 續(xù)表達(dá)pre-miRNA /經(jīng)過Drosha( RNase 口)乍用形成 small hairpin pre-miRNAs。在使用載體法針對某一 MicroRNA 進(jìn)行過表達(dá)研究過程中，通常會遇到 如下幾個問題：實(shí)驗(yàn)對照組的確立、

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定、基因表 達(dá)效率的檢 測。1、實(shí)驗(yàn)對照組的確立 在一個完善的 MicroRNA 表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，必須 考慮設(shè)立正確合理的實(shí)驗(yàn)對照組。通常，這些對照組包括載體陰性對 照組、轉(zhuǎn)染試劑 對照組。 載體陰性對照可以有兩種，一種是采用通 用 的 陰性對照組， 在本試劑盒中包括了該對照所需的 載體(microRNA ),可以表達(dá)與目的基因序列無同源性的microRNA片 段；另一種是將目的 microRNA 的序列打亂后重新組合所得的陰性 對照( scrambled)。 對照組的設(shè)立對于 MicroRNA 表達(dá)研究是很有 必要的，您可以利用載體對照來確認(rèn) microRNA 實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染、

3、RNA 提取和基因表達(dá)檢 測方法的可靠性。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定使用 MicroRNA 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，為了選擇合適的轉(zhuǎn)染方法和確定 轉(zhuǎn)染效率，通常采用報告基因來檢測 DNA 的導(dǎo)入情況。最常用的 報 告基因是綠色熒光蛋白。3、 MicroRNA 表達(dá)的檢測 通常用兩大類方法來檢測 MicroRNA 表達(dá) 效率，一類方法是直接檢測 MicroRNA 的變化水平，常用的方法如 northern雜交、芯片（microarrays ）以及核糖核酸酶保護(hù)分析，但這 些傳統(tǒng)的方法都需要用到標(biāo)記探針與純化的 RNA 進(jìn)行雜交，由于成 熟的 miRNAs 及其前 體共享一段共同的靶序列，而且目前的這些方 法

4、有無法通過大小將其分開，因此很難專一識別成熟的 MicroRNA， 導(dǎo)致較高的背景信號。另一類方法是通過檢測目的基因的生物學(xué)效應(yīng) 和細(xì)胞效應(yīng)來間接的反映目的基因的表達(dá)變化，這一類方 法很多， 不同的基因有不同的檢測方法。通常選用直接檢測 MicroRNA 的變 化情況，可以很直觀地反映基因的真實(shí)情況，不過也有一部分 研究 人員通過檢測細(xì)胞效應(yīng)如細(xì)胞增殖速率等指標(biāo)間接反映基因變化。 轉(zhuǎn)染條件的確定轉(zhuǎn)染前一天，接種0.4-13105細(xì)胞/孔至24孑L板中，加入500卩1含 血清培養(yǎng)液，37C 5% CO2培養(yǎng)至40-70%融合。 在50卩1 Opti-MEM I培養(yǎng)液或其它無血清培養(yǎng)液中加入0.5

5、-0.8yg DNA，混勻。使用前輕輕混勻RNAi-Mate試劑，切忌離心處理。用30卩1無血清的DMEM或Opti-MEM ,或其他無血清培養(yǎng)基）稀釋1-4pg RNAi- Mate 試劑（可以分別設(shè)立 DNA/RNAi-Mate 的不同用 量組，通常 DNA 和 RNAi-Mate 的用量在 1：2-1：5 范圍內(nèi)，針對不同的細(xì)胞 需要不同的用量）， 輕輕混勻，室溫放置 5 分鐘。將稀釋好的DNA和RNAi-Mate試劑混合，定容到100卩1 ；輕柔混 勻，室溫放置 30 分鐘， 以便形成 DNA-Mate 復(fù)合物。將100卩1 DNA/RNAi-Mate復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板

6、 的孔中，來回輕柔搖晃 細(xì)胞培養(yǎng)板板，使 DNA/RNAi-Mate 混合物 均勻覆蓋細(xì)胞。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37口溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢 測步驟。如果細(xì)胞株比 較敏感，孵育 4-6 小時后，除去復(fù)合物，更 換培養(yǎng)基。通過表達(dá)綠色熒光蛋白的 DNA 載體來檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后 24-48 h 后，使 用熒光顯微鏡觀察計數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白的 細(xì)胞，在明場觀察計數(shù)同一視野中的總細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn) 染細(xì)胞率=熒光蛋 白表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)TOO%?；蚴褂肈API等染料染核后，吏用流 式細(xì)胞 儀進(jìn)行計數(shù)，然后計算轉(zhuǎn)染效率。如果在轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)中沒有找到較高效率的轉(zhuǎn)染方法，請更

7、換 轉(zhuǎn)染方法和試劑。如 無其他方法選擇，可以使用流式細(xì)胞儀將轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞分選出來用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果無法分選細(xì) 胞，可以在計算 RNA 干擾抑制效率時去除轉(zhuǎn)染效率的影響，也可以使用抗生素對轉(zhuǎn)染后的 細(xì) 胞進(jìn)行初篩后再進(jìn)一步檢測抑制效率。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染設(shè)定合理的實(shí)驗(yàn)組/包括轉(zhuǎn)染試劑對照(mock transfection)、陰性 對照(negative control)和目的基因?qū)嶒?yàn)組。按照前面實(shí)驗(yàn)確定的細(xì)胞接種量接種。37C 5% CO2培養(yǎng)至40- 70%融合。按照前面實(shí)驗(yàn)確定的轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如果需要轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)量的細(xì)胞，試劑的用量可 以根據(jù)相關(guān)參考進(jìn)行相應(yīng)的變化。轉(zhuǎn)染后 24-48h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步的檢測工作。通常，目的 基因在轉(zhuǎn)染后 24-48h 內(nèi) 就會表現(xiàn)出現(xiàn)表達(dá)，但有一些蛋白比如 穩(wěn)定性較強(qiáng)、半衰期較長的蛋白在轉(zhuǎn)染后含量降低比較 緩慢，所 以需要延長檢測時間。穩(wěn)定細(xì)胞系建立前一天，準(zhǔn)備健康細(xì)胞，密度在 20%-40%。MicroRNA 表達(dá)載體和對照，按照轉(zhuǎn)染試劑推薦要求，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 小 時后換成新鮮 培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜。第二天，胰酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中(如 6 孔板轉(zhuǎn)到 10cm plat