小兒水楊酸苯酚搽劑的毒理學(xué)研究

1、小兒水楊酸苯酚搽劑的毒理學(xué)研究【摘要】目的：為小兒水楊酸苯酚搽劑成品制劑的臨床平安使用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法：觀察大鼠完好皮膚及破損皮膚一次性涂抹最大耐受量TD的小兒水楊酸苯酚搽劑所產(chǎn)生的毒性反響情況，從給藥0時(shí)起至7d連續(xù)觀察記錄動(dòng)物的急性毒性和45d連續(xù)的長(zhǎng)期毒性反響，以皮膚刺激反響標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展評(píng)分作毒理等級(jí)評(píng)價(jià)；對(duì)存活動(dòng)物在觀察完畢時(shí)進(jìn)展高位脫椎處死采血檢測(cè)外周血常規(guī)和血清生化，解剖后裸眼和病理切片觀察心、腦、肝、腎等主要臟器的病理變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Bliss法處理計(jì)算LD50。結(jié)果：未測(cè)出LD50值；皮膚完好與破損組動(dòng)物均產(chǎn)生輕度刺激反響；外周血常規(guī)和血清生化均未見明顯改變；心、腦、肝、腎等重要

2、臟器裸眼和病理切片均未見明顯病理改變。結(jié)論：小兒水楊酸苯酚搽劑在小于TD2000g/(kgd)40L/(kgd)劑量下一次性涂大鼠皮膚后該劑量相當(dāng)于臨床劑量的800倍以及1000、500、200g/(kgd)劑量的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，均未產(chǎn)生明顯毒副反響。1儀器與試藥1.2試驗(yàn)材料1.2.1試藥小兒水楊酸苯酚搽劑處方為：水楊酸50g、苯酚10g、花生油加至1000g。批號(hào)060206、060302、060307，本院制劑室提供；硫化鈉天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20220602；羧甲基纖維素湖南藥用試劑廠，批號(hào)2022021。1.2.2動(dòng)物SPF級(jí)SD、istar大鼠，體重20020g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)

3、動(dòng)物中心提供，答應(yīng)證號(hào)SXK渝20020001，環(huán)境設(shè)施合格證醫(yī)動(dòng)字第310103002號(hào)。2方法與結(jié)果2.1皮膚部分刺激強(qiáng)度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)228對(duì)皮膚部分刺激反響的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，擬定本試驗(yàn)紅斑和水腫均按4分制，最高與最低分分別是4和0分。紅斑評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)紅斑0分，勉強(qiáng)可見紅斑1分，明顯紅斑2分，中度到嚴(yán)重紅斑3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成4分。水腫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)水腫0分，勉強(qiáng)可見水腫1分，皮膚隆起輪廓可見水腫2分，皮膚隆起近1水腫3分，水腫隆起1并范圍擴(kuò)大4分。對(duì)皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)分為無(wú)刺激和輕、中、重度刺激4級(jí)，對(duì)應(yīng)分值分別為00.49、0.52.99、3.05.99和6.08.0分。2.2完好

4、和破損動(dòng)物皮膚的急性毒性試驗(yàn)2.2.1完好皮膚最大耐受量的預(yù)試參考文獻(xiàn)2283在室溫23.52，相對(duì)濕度40%85%的實(shí)驗(yàn)室中，取SPF級(jí)SD大鼠10只，雌雄各半，試驗(yàn)前24h用10%硫化鈉溶液脫毛劑脫去背部約為體外表積10%的毛發(fā)，禁食、自由飲水12h后，參考臨床常用劑量0.05L/(kgd)以5%水楊酸苯酚搽劑g/g的水楊酸計(jì)為2.5g/(kgd)作為初始預(yù)試量涂搽試驗(yàn)大鼠的脫毛皮膚處，并以初始劑量的2、4、8、64、256和1024倍即為5、10、40、640、2560g/(kgd)的劑量進(jìn)展反復(fù)預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果在2560g/(kgd)以下未見明顯異常反響。表1SD大鼠皮膚一次性涂抹小兒水楊

5、酸苯酚搽劑后的毒性反響略2.2.2皮膚刺激試驗(yàn)取SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只。1完好皮膚對(duì)照組：供羧甲基纖維素行完好皮膚陰性對(duì)照試驗(yàn)；2破損皮膚對(duì)照組：用大頭針均勻劃破皮膚為字形，以滲血為準(zhǔn)，造成損傷性皮膚，供羧甲基纖維素行皮損空白試驗(yàn)；3破損皮膚試驗(yàn)組：用大頭針均勻劃破皮膚為字形，以滲血為準(zhǔn)，造成損傷性皮膚，供小兒水楊酸苯酚搽劑行皮損試驗(yàn)；4完好皮膚試驗(yàn)組：保持完好皮膚供小兒水楊酸苯酚搽劑試驗(yàn)。按“2.2.2的方法分別給試驗(yàn)組大鼠以40L/(kgd)2000g/(kgd)劑量一次性涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑，然后用紗布和油紙包扎24h后用溫水洗凈受試藥物的給藥部位，

6、在給藥后0、1、3、6、12、24、48、72h至第7d，每日觀察并記錄試驗(yàn)動(dòng)物的生理活動(dòng)，結(jié)果各組試驗(yàn)大鼠的體重、皮膚、毛發(fā)、眼粘膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等表現(xiàn)正常，試驗(yàn)組與對(duì)照組之間體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義2=9.86，P=0.6127，均無(wú)動(dòng)物死亡，并按“2.1皮膚刺激反響評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分定量評(píng)價(jià)見表2。試驗(yàn)完畢時(shí)將各試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組大鼠頸椎高位脫位處死并立即解剖，裸眼仔細(xì)觀察心、腦、肝、腎、肺、脾等重要器官的改變。2.2.3外周血常規(guī)1檢測(cè)指標(biāo)：紅細(xì)胞、血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞、平均血紅蛋白量、紅細(xì)胞壓積、平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、血小板平均體積

7、、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、中間粒細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比等。2檢測(cè)方法：儀器法。結(jié)果見表3。表2SD大鼠皮膚一次性涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑的皮膚刺激試驗(yàn)略表3小兒水楊酸苯酚搽劑一次性涂抹SD大鼠外周血常規(guī)結(jié)果略2.2.4血清生化1檢測(cè)指標(biāo)：總膽紅素、直接膽紅素、總蛋白TP、白蛋白ALP、球膽白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT、谷草轉(zhuǎn)氨酶GT、谷草/谷丙比、堿性磷酸酶AKP、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、乳酸脫氫酶、血糖、甘油三酯TG、尿素氮UREA、肌酐REA、尿酸等。2檢測(cè)方法：所有酶類生化指標(biāo)均采用速率法，尿素采用尿酶法，肌酐采用苦味酸終點(diǎn)法，尿酸采用尿酸酶

8、紫外法，總蛋白采用雙縮脲法，白蛋白、球蛋白采用溴甲酚綠法。結(jié)果見表4。表4小兒水楊酸苯酚搽劑一次性涂抹SD大鼠皮膚后的血清生化結(jié)果略*GPT項(xiàng)與對(duì)照組比擬P0.05，其余各項(xiàng)與對(duì)照組比擬P0.052.3病理組織切片及分析所有急性毒性試驗(yàn)大鼠在試驗(yàn)觀察完畢后頸椎高位脫位處死，仔細(xì)裸眼觀察有無(wú)明顯病理改變，隨即采集心、肝、腎、肺、脾等重要臟器置于福爾馬林溶液中固化24h，切成組織小片，再經(jīng)12h固化，以不同濃度乙醇梯度脫水8h后浸蠟2h，枯燥后置于冰凍切片機(jī)上切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，37枯燥后經(jīng)HE染色、封片，制作好病理切片后置于生物顯微鏡ZEiSAXLSKP400下，在40100倍視野下觀察病理改變

9、。裸眼仔細(xì)觀察心、腦、肝、腎、肺、脾等重要器官未見明顯異常改變，100倍生物顯微鏡下病理切片見圖14。2.4長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)22023、4取體重為200g的istar大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，常規(guī)飼養(yǎng)7d，經(jīng)查血常規(guī)及肝、腎功能正常后供試驗(yàn)。參考SD大鼠的TD值并以其0.50、0.25、0.10倍設(shè)計(jì)3個(gè)劑量組：1000、500、200g/(kgd)和1個(gè)羧甲基纖維素對(duì)照組，按“2.2.2的方法，分別給各試驗(yàn)組istar大鼠用藥，對(duì)照組給予同體積的羧甲基纖維素，每天定時(shí)給藥一次，用油紙包扎脫毛處皮膚3h，連續(xù)45d。每天給藥后仔細(xì)觀察各動(dòng)物的活動(dòng)：外觀體征、行走情況、飲食、糞

10、便、尿液等有無(wú)異常，每天按時(shí)測(cè)定體重一次，并根據(jù)大鼠體重變化調(diào)整給藥量。紀(jì)錄各項(xiàng)觀察指標(biāo)，給藥完畢時(shí)及停藥14d各劑量組隨機(jī)取1/3的動(dòng)物在DADEBEHRINGDIENSINRL全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)展血液學(xué)的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等外周血象的常規(guī)檢測(cè)和肝、腎等重要器官的生化指標(biāo)監(jiān)測(cè)包括TP、ALP、AST、ALT、GPT、GT、AKP、血糖、TG、REA、UREA等。結(jié)果外周血象正常，生化除GPT高劑量組有明顯升高外P0.05，其余各組與對(duì)照組比擬均無(wú)顯著變化P0.05，見表5。另將中途死亡或檢測(cè)完畢的動(dòng)物迅速剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮、睪丸等器官，肉眼觀察有無(wú)異常。并對(duì)

11、各組的心、肝、肺、腎、脾等臟器進(jìn)展病理組織切片檢查，結(jié)果高劑量組的各重要臟器均未見明顯的組織病變。圖1小兒水楊酸苯酚搽劑一次按TD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的心肌病理切片(410)略圖3小兒水楊酸苯酚搽劑一次按TD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的腎組織病理切片(1010)略圖2小兒水楊酸苯酚搽劑一次按TD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的肺組織病理切片(1010)略圖4小兒水楊酸苯酚搽劑一次按TD劑量涂抹大鼠破損皮膚后的肝組織病理切片(410)略表5istar大鼠皮膚涂抹小兒水楊酸苯酚搽劑45d的生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果略*GPT項(xiàng)與對(duì)照組比擬P0.05，其余各項(xiàng)與對(duì)照組比擬P0.053討論小兒水楊酸苯酚搽劑由水楊酸、苯酚

12、、花生油等多種成分配制而成的復(fù)方外用搽劑，具有良好的殺菌、抑制霉菌、溶解角質(zhì)膿痂的作用，常用于黃癬、膿痂疹、毛囊角化癥及魚鱗癬等多種皮膚玻其處方中主藥成分為水楊酸，濃度為5g/g，為便于本試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量均以水楊酸的量作計(jì)算和設(shè)計(jì)。由于動(dòng)物體外表積不便直接測(cè)定，按文獻(xiàn)對(duì)體外表積與體重進(jìn)展近似換算體外表積2：A=R2/3，其中，A為動(dòng)物體外表2，為體重kg，R是動(dòng)物的體型系數(shù)，參考文獻(xiàn)2大鼠本實(shí)驗(yàn)取0.09，從而獲得相對(duì)準(zhǔn)確的動(dòng)物試驗(yàn)劑量。為便于文字表達(dá)，本文試驗(yàn)劑量均以公斤體重劑量表示。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，小兒水楊酸苯酚搽劑在劑量2000g/(kgd)該劑量相當(dāng)于臨床劑量的800倍給大鼠一次涂搽皮膚后完好皮膚可出現(xiàn)紅斑、細(xì)微水腫等輕度刺激反響，35d內(nèi)可恢復(fù)正常。該劑量對(duì)破損皮的刺激反響稍強(qiáng)，皮膚劃傷處有紅斑、水腫等刺激反響出現(xiàn)，皮膚再次長(zhǎng)毛時(shí)間較空白試驗(yàn)組平均晚12d，在57d內(nèi)均可恢復(fù)正常。以上劑量雖對(duì)破損的皮膚刺激反響稍強(qiáng)，但評(píng)分仍在輕度刺激反響范圍，均可在57d內(nèi)恢復(fù)。該劑量無(wú)論