微生物實(shí)驗(yàn)思考題參考答案及知識(shí)要點(diǎn)

1、微生物實(shí)驗(yàn)思考題參考答案及知識(shí)要點(diǎn)一酵母菌形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒別1.呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同對(duì)酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響?是分析其原因。美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變成為無(wú)色的還原型。因此， 具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對(duì)酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。美藍(lán)濃度高了，代謝不太活躍的活細(xì)胞也會(huì)被染色，從而使觀察到的死細(xì)胞較多，活細(xì)胞較少；反之，則代謝微弱的細(xì)胞也能還原美藍(lán)，不被染色，從而使觀察到

2、的死細(xì)胞較少，活細(xì)胞較多。二 . 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色革蘭氏染色中那一步是關(guān)鍵?為什么？你是如何操作的？革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟是：乙醇脫色（是脫色時(shí)間）。如果脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片的厚薄，脫色是玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量的多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定（脫色是應(yīng)當(dāng)控制速度，脫色時(shí)間一般為20 30s） 。固定的目的之一是殺死菌體，這與自然死亡的菌體有何不同？自然死亡的菌體本身已經(jīng)部分自溶，結(jié)構(gòu)已經(jīng)改變。固定殺死細(xì)菌時(shí)細(xì)菌結(jié)構(gòu)是保持死亡時(shí)的狀態(tài)的。不經(jīng)復(fù)染這一步能否區(qū)分革蘭

3、氏陽(yáng)性菌和陰性菌？能。在酒精脫色后，不被酒精脫色而保留紫色者為革蘭氏陽(yáng)性菌（G） ，被酒精脫色為革蘭氏陰性菌。最后一步用番紅染液復(fù)染，是為了讓結(jié)果更清楚。涂片為什么要固定，固定適應(yīng)注意什么問(wèn)題？a 殺死細(xì)菌并使菌體黏附與玻片上；b 增加其對(duì)染料的親和力。固定時(shí)應(yīng)注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火過(guò)3 次 （手指觸摸玻片反面，不燙手為宜），固定時(shí)應(yīng)盡可能維持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。三 . 霉菌、放線菌的形態(tài)觀察鏡檢時(shí)，如何區(qū)分基內(nèi)菌絲與氣生菌絲？一般氣生菌絲顏色較深，直生或分枝絲狀，比基內(nèi)菌絲粗；而基內(nèi)菌絲色淺、發(fā)亮，可看到橫隔膜，繼而斷裂成球狀或桿狀小體。顯微鏡下細(xì)菌放線菌 酵母菌和霉

4、菌的主要區(qū)別是什么？放線菌與細(xì)菌需要在油鏡下才能觀察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍鏡下即可看到。細(xì)菌：為細(xì)而短的單細(xì)胞微生物（個(gè)體微小），主要形態(tài)有：球、桿、螺旋狀等。（部分桿菌還可形成芽孢）放線菌：存在分枝絲狀體和菌絲體，革蘭氏陽(yáng)性菌，有孢子絲和孢子（球形、橢圓形、 桿狀、柱狀） 。酵母菌：?jiǎn)渭?xì)胞，菌體呈圓球、卵形或橢圓形，少數(shù)呈檸檬形、尖形等。菌體比細(xì)菌大幾倍到幾十倍，部分處于出芽繁殖過(guò)程中菌體還可觀察到芽體，大多數(shù)菌體上還有芽痕。霉菌：菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍到幾十倍，在低倍鏡下即可看到，并還可看到孢子囊梗、囊軸、孢子囊、包囊孢子等。四 . 玻璃器皿的

5、洗滌、包扎與滅菌高壓蒸汽滅菌開(kāi)始時(shí)為什么要將鍋內(nèi)排盡？滅菌后為什么要待壓力降低到“ 0”時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物？因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以?當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0 時(shí)，打開(kāi)排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡（壓力突然下降而發(fā)生復(fù)沸騰）而沖出燒瓶口或試管口，造成培養(yǎng)基等液體沾濕棉塞或溢出等事故。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較干熱滅菌和濕熱滅菌的效果。以下試驗(yàn)方案有關(guān)操作均遵循無(wú)菌操作條件和等量原則。實(shí)驗(yàn)材料 TOC o 1-5 h z 試管 鑷子 酒精燈 嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC 7053

6、 菌片 紙片 （與菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（已滅菌）等實(shí)驗(yàn)材料（材料有余）。對(duì)照組取 9 支潔凈試管，分為A1 B1 C1 三組（每3 支一組） ，將 A1 組中放入菌片，B1 組中放入紙片，C1 組中什么也不加；不經(jīng)滅菌，直接加入溴甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（等量）。實(shí)驗(yàn)組取 18支潔凈試管，分為 A21A22 B21B22 C21 C22 六組 （每 3支一組） ， 將 A21 A22組中加入菌片，B21B22 中加入紙片，C21 C22 中什么也不加；其中 A21B21 C21 進(jìn)行 1602 小時(shí)干熱滅菌；其中 A22B22 C22 進(jìn)行 12120 分鐘濕熱滅菌，滅菌完畢，

7、冷卻后加入溴甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（等量）。恒為培養(yǎng)將上述所有試管按分組在56恒溫條件下培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果處理將培養(yǎng)后的結(jié)果進(jìn)行記錄，制表進(jìn)行比較，得出滅菌效果。重復(fù)試驗(yàn)多次（10 幾次）重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，得出普遍結(jié)果。為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需溫度高時(shí)間長(zhǎng)？在濕熱條件下，有水蒸汽的作用：a 高溫水蒸汽導(dǎo)熱比干空氣要快；b 高溫水蒸汽冷凝變水時(shí)有放熱過(guò)程；c 高溫水蒸汽能穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞細(xì)胞；c 高溫水蒸汽能水解一部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速導(dǎo)熱。（濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的穿透力比干熱大；濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1 克水在

8、100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出 2 26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。 ）五 . 培養(yǎng)基的配置配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，有哪些操作步驟？那幾步易出錯(cuò)，如何防止？稱取藥品加熱溶化分裝加棉塞包扎滅菌擱置斜面易出錯(cuò)的步驟有：a 稱取藥品稱取時(shí)鑰匙專用，瓶蓋不要錯(cuò)蓋，易吸水的藥品要快速稱??；b 加熱溶化加入藥品后要用玻璃棒不停攪拌，以免糊底（在瓊脂熔化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器，同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。） ；c 分裝分裝時(shí)培養(yǎng)基不能粘在三角瓶（或試管）口，以免接種時(shí)染菌；d 擱置斜面斜面長(zhǎng)度約試管長(zhǎng)度一半為宜。配制培養(yǎng)基的一

9、般原則是什么？a 目的明確b 營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)c 理化適宜d 經(jīng)濟(jì)節(jié)約六 . 平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法的原理是什么? 它適用于那些微生物的計(jì)數(shù)？平板菌落計(jì)數(shù)法是將等測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成的肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。（但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的23 或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低?，F(xiàn)在常使用菌落形成單位）。平板計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基

10、上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)微生物繁殖而形成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是一個(gè)菌落可代表一種微生物（并不絕對(duì)）。通常用來(lái)測(cè)定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。菌落樣液移入培養(yǎng)皿后，若不盡快地倒入培養(yǎng)基并充分搖勻，將會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果？為什么？出現(xiàn)的結(jié)果是：形成菌落過(guò)于集中，不能形成均勻分布的單菌落，導(dǎo)致無(wú)法計(jì)數(shù)。因?yàn)椋?若不立即搖勻，菌體常會(huì)吸附在皿底上，不易形成均勻分布的單菌落，從而影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。要獲得本次試驗(yàn)的成功，那幾步最為關(guān)鍵？為什么？a 稀釋菌液若在稀釋時(shí)移液管混用可使稀釋梯度不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差（放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不

11、精確，結(jié)果誤差大。 ） ；b 稀釋倒平板1 若再加入菌液不立即倒入培養(yǎng)基，可使菌體黏附于皿底；若不注意培養(yǎng)基溫度，溫度過(guò)高會(huì)將菌體燒死，溫度過(guò)低會(huì)使培養(yǎng)基一倒入立即凝固，從而菌體不能均勻分布；倒入培養(yǎng)基需立即搖勻，否則菌體常會(huì)吸附在皿底上，不易形成均勻分布的單菌落，從而影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；選擇倒平板的稀釋梯度也是很重要的，一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50 個(gè)左右為宜，否則要適當(dāng)增加（或減少）稀釋度加以調(diào)整。4.平板菌落計(jì)數(shù)法與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比有何優(yōu)缺點(diǎn)？微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法隨機(jī)性大,所以對(duì)菌體數(shù)量不能做出較為宏觀,全面的反應(yīng).顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一般與血球計(jì)

12、數(shù)板配套使用.但顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是快速,觀察到馬上可以計(jì)數(shù)，而計(jì)的是相應(yīng)微生物總數(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法最大的缺點(diǎn)是速度慢, 需要平板上長(zhǎng)出菌落一段時(shí)間后才能計(jì)數(shù). 但是由于平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋, 所以計(jì)數(shù)的線性范圍大. 由于是菌懸液涂布, 所以比較均勻 , 能較好的反應(yīng)菌落的疏密程度. 重復(fù)性 , 平行性很好, 而計(jì)的是活菌數(shù)。是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法.七 . 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法為何用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板可計(jì)得樣品總菌值？敘述其適用范圍。a 計(jì)數(shù)室體積一定；b 在顯微鏡下，不經(jīng)染色不能分辨菌體的死活，使計(jì)數(shù)所得的數(shù)目為一定體積內(nèi)的總菌數(shù)，從而計(jì)得樣品中總菌值。適用范圍：可單細(xì)胞存在的細(xì)菌酵母菌或顯絲狀

13、生長(zhǎng)的真菌，放線菌所生的孢子等。為什么計(jì)數(shù)室內(nèi)不能有氣泡？試分析產(chǎn)生氣泡的可能原因。a 氣泡會(huì)占據(jù)計(jì)數(shù)室的空間，導(dǎo)致計(jì)數(shù)室中的菌體個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)偏小，最后導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏小。b 計(jì)數(shù)室內(nèi)的氣泡，可影響菌液的隨機(jī)分布，使計(jì)數(shù)產(chǎn)生誤差。產(chǎn)生氣泡原因：a 操作不當(dāng)，先放菌液再蓋蓋玻片；b 計(jì)數(shù)室洗滌不干凈；c 蓋玻片移動(dòng)，造成空氣進(jìn)入而產(chǎn)生氣泡。試分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差來(lái)源及提出改進(jìn)措施？1、儀器誤差：所用器材均應(yīng)清潔干凈，并且計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)不應(yīng)該有擦痕。2、計(jì)數(shù)室內(nèi)可能有氣泡。因?yàn)榻湍讣?xì)胞并沒(méi)有染色，看起來(lái)是透明的，有氣泡很容易被計(jì)入，使數(shù)值偏高；并且，氣泡會(huì)影響菌懸液的隨機(jī)分布。改進(jìn)：若產(chǎn)生氣泡，則用吸

14、水紙吸出。3、菌體在計(jì)數(shù)板上分布不均，當(dāng)用選取5 格計(jì)數(shù)時(shí)，會(huì)造成很大誤差。改進(jìn)：應(yīng)使菌液自然流入并混勻，進(jìn)行觀察時(shí)盡可能多數(shù)幾個(gè)格子。4、配制稀釋液時(shí)吸取的濃度過(guò)高或過(guò)低，導(dǎo)致稀釋液濃度和原液不成正確比例，計(jì)算時(shí)產(chǎn)生誤差。應(yīng)將原液搖晃均勻后取中部的液體進(jìn)行稀釋。5、由于數(shù)菌體數(shù)目時(shí)視覺(jué)疲勞而導(dǎo)致的視覺(jué)誤差。應(yīng)多人觀察，取記錄平均數(shù)。6、計(jì)數(shù)時(shí)可能將格四周的菌都計(jì)算在內(nèi)了，使數(shù)值偏高。改進(jìn)：謹(jǐn)遵一個(gè)規(guī)則，計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，不可以重復(fù)計(jì)數(shù)。7、 可能出現(xiàn)有出芽的酵母菌，將出芽的酵母菌按兩個(gè)計(jì)數(shù)了，使數(shù)值偏高。改進(jìn)： 計(jì)數(shù)時(shí)，只有當(dāng)芽體于母細(xì)胞一樣大的時(shí)候，才能計(jì)為兩個(gè)。8、微量移液器的最小

15、量程太大，在加樣時(shí)，容易加多，使蓋玻片鼓起，血球計(jì)數(shù)板所技術(shù)的體積變大，最終結(jié)果偏大。改進(jìn)：用量程的小的微量移液器并少加一些。八 . 微生物的純培養(yǎng)技術(shù)1. 如果一項(xiàng)科學(xué)研究?jī)?nèi)容需從自然界中篩選到能產(chǎn)生高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？寫出實(shí)驗(yàn)方案（產(chǎn)蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。以下試驗(yàn)方案有關(guān)操作均遵循無(wú)菌操作條件一 材料準(zhǔn)備土壤【有機(jī)質(zhì)（特別是蛋白質(zhì)）含量豐富的土壤】滅菌生理鹽水（0.85%NaCl）滅菌移液管添加酪素的B 4（牛肉膏蛋白胨完全培養(yǎng)基）經(jīng)滅菌B 4 斜面（經(jīng)滅菌）其他材料：接種環(huán)酒精燈等二 操作方法在盛有 10ml 滅菌生理鹽水的燒杯中添加1g 土壤，配成懸浮液；稍靜止后，用滅菌移液管移取部分上清液，將其制成104 106 倍的稀釋液； TOC o 1-5 h z 用滅菌移液管吸取各稀釋液用稀釋倒平板法（或涂布平板法）將其接入添加酪素的B 4平板上；在 55 65下培養(yǎng)1 2 天；挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直徑D 與菌落直徑d 之比較大者），轉(zhuǎn)接入B 4 斜面上培養(yǎng)；（若無(wú)特定菌落形成，則需另取土樣從開(kāi)始重復(fù)試驗(yàn)）將 B 4 斜面上的菌落再用平板純培養(yǎng)，依次重復(fù)2 3 次后即可得到純培養(yǎng)（鏡檢）；純培養(yǎng)細(xì)菌中蛋白酶的提取及活性鑒定【搖瓶培養(yǎng)（若提取蛋白酶及其活性正常，則純培養(yǎng)成功