電子科大細(xì)胞生物學(xué)第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 概要了解細(xì)胞生物學(xué)常用研究方法，包括細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法、細(xì)胞組分分析方法、細(xì)胞培養(yǎng)方法、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)等。本章學(xué)習(xí)要求細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法細(xì)胞組分分析方法細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)本章主要教學(xué)內(nèi)容第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy) 肉眼的分辨率：0.2mm； 光鏡分辨率： 0.2um； EM分辨率可達(dá)到0.2nm1m=103mm=106um=109nm2、熒光顯微鏡技術(shù)原理與應(yīng)用 直接熒光標(biāo)記技術(shù) 間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 應(yīng)用：在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位。（Fluorescence

2、Microscopy）（Laser Scanning Confocal Microscopy）物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一小點(diǎn)，彼此互相共聚焦。激光束（光源）經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)。從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光（樣3、激光共焦掃描顯微鏡技術(shù) 原理品一般經(jīng)免疫熒光標(biāo)記）經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測器檢出。通過樣品其他部位的激光即激光發(fā)出的熒光不會聚焦成像，因而檢測器不能檢出。排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用：4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance enerrgy transfer, FRET） 用于檢

3、測活細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子之間的直接相互作用。 供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊，且兩個探針距離在10nm范圍以內(nèi)時，會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。 可選擇供體蛋白CFP和受體蛋白YFP分別與兩種目的蛋白融合表達(dá)。當(dāng)這兩個融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP所吸收，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光。此時可通過測量CFP熒光強(qiáng)度的損失量來確定這兩個蛋白是否相互作用。兩個蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測器所接收到的熒光越少。反之，不會產(chǎn)生FRET效應(yīng)。5、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（fluorescence recovery

4、 after photobleaching, FRAP） 該技術(shù)起源于20世紀(jì)70年代。使用與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)耦聯(lián)的親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等，檢測活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。 是研究膜蛋白或膜脂流動性的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 熒光素標(biāo)記膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射細(xì)胞表面某一區(qū)域，使被照射區(qū)的熒光淬滅變暗。由于膜的流動性，淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加，最后恢復(fù)到與周圍的熒光強(qiáng)度相等。根據(jù)熒光恢復(fù)的速度可推算出膜蛋白或膜脂擴(kuò)散速度。 抗鼠細(xì)胞膜蛋白的熒光抗體（顯綠色熒光）和抗人紅細(xì)胞蛋白的熒光抗體（顯紅色熒光）分別標(biāo)記小鼠和人的細(xì)胞表面，然

5、后用滅活的仙臺病毒處理使兩種細(xì)胞融合。10min后不同顏色的熒光在融合細(xì)胞表面開始擴(kuò)散，40min后已分辨不出融合細(xì)胞表面綠色熒光或紅色熒光區(qū)域。證明膜蛋白的流動性二、 電子顯微鏡技術(shù) 透射電鏡（TEM）1) 超薄切片技術(shù)2) 負(fù)染色技術(shù)3) 冰凍蝕刻技術(shù)4) 真空噴鍍技術(shù)5) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM） 透射電鏡的基本構(gòu)造 透射電鏡主要制樣技術(shù)（1）透射電鏡基本構(gòu)造1、透射電鏡 （TEM） 顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200nm可見光玻璃透鏡不要求真空利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化100nm紫外光玻璃透鏡

6、不要求真空TEM0.1nm電子束電磁透鏡要求真空（1.33x10-51.33x10-3Pa）利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差 （2）電鏡與光鏡的比較 戊二醛：是一種化學(xué)交聯(lián)劑，滲透速率較四氧化鋨快，能固定蛋白和糖類（特別是糖原）。一般用戊二醛進(jìn)行前固定。但對大多數(shù)脂類的固定作用不強(qiáng)，樣品僅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化鋨進(jìn)行后固定。常用的固定劑：醛類固定劑、四氧化鋨等單一固定劑不能固定細(xì)胞內(nèi)所有組分，常需聯(lián)合使用不同固定劑。常采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定。 四氧化鋨：是一種重金屬化合物，能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，是膜結(jié)構(gòu)最佳固定劑。四氧化鋨在隨后的脫水過程中可被還原形成鋨黑，使樣

7、品反差增強(qiáng)。但四氧化鋨滲透緩慢，對酶活性和抗原活性破壞較大。取材與固定超薄切片一般收集在金屬載網(wǎng)上進(jìn)行觀察。常用銅網(wǎng)為200400目，此外根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求還可選用金網(wǎng)、鎳網(wǎng)等。載網(wǎng)上一般包被一層支持膜，以支撐載網(wǎng)上的超薄切片，增加其穩(wěn)定性。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉膠、碳等。包埋好的組織塊需在超薄切片機(jī)上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片。切片生物樣品多數(shù)是由碳、氫、氧、氮等元素組成的，這些元素的原子序數(shù)低，散射電子的能力不強(qiáng)，在電鏡下的反差非常弱，因此通常需用高分子量的金屬鹽來對超薄切片進(jìn)行染色，由于細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)對金屬鹽的親和力不同，因此染色后不同結(jié)構(gòu)對電子的散射能力亦

8、不同，從而增強(qiáng)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反差。常用染色液:醋酸雙氧鈾和鉛染液電鏡觀察染色與觀察大鼠骨髓干細(xì)胞的超薄切片（引自G.M.Wright et al） 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).2）負(fù)染色技術(shù)常用染色劑

9、：2磷鎢酸水溶液（Negative staining）家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片(病毒直徑20nm)（陳立華、翟中和） 制備過程簡單，只需將樣品制成懸液，直接滴于載網(wǎng)上，然后用重金屬物質(zhì)染液染色。即可在EM下觀察。重金屬物質(zhì)散射電子的能力較樣品本身強(qiáng)，電鏡下兩者顯示出明顯的明暗對比，樣品呈亮色，而其周圍的背景將呈暗色，這樣樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)就被襯托出來。常用染色劑：2磷鎢酸水溶液 真空噴鍍一般在噴鍍儀中進(jìn)行，將鉑、鉻、金等重金屬在高真空條件下加熱，使其蒸發(fā)，蒸發(fā)出來的金屬粒子以一定的角度斜向噴鍍于樣品表面，這樣凸出的樣品表面將比周圍背景優(yōu)先包被一層金屬薄膜，二者之間的反差加大，樣品輪廓清晰地顯

10、示出來。 單方向噴鍍，樣品向著金屬發(fā)射源一面沉積金屬粒子較多，而背側(cè)面較少，形成投影。增強(qiáng)樣品反差，樣品富立體感。 旋轉(zhuǎn)噴鍍，可使樣品表面的金屬薄膜均勻一致。3）真空噴鍍技術(shù)a）快速冷凍b）低溫斷裂c）蝕刻d）復(fù)型主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。4）冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etching）樣品在低溫下迅速冷凍（液氮或液氦中）和低溫下，結(jié)構(gòu)“脆弱”部位（膜脂雙分子層疏水端）斷裂，顯示出膜脂中的蛋白質(zhì)顆粒，真空中冰升華，進(jìn)一步增強(qiáng)“浮雕”式蝕刻效果，鉑金噴鍍形成凹凸電子反差，真空噴鍍碳膜，樣品再經(jīng)消化液消化，收集復(fù)型膜在電鏡下觀察。2、掃描電鏡（SEM）CO 2臨界點(diǎn)干燥法防止主

11、要觀察樣品表面的形貌特征。 應(yīng)用原理溫度以上使CO2以氣態(tài)形式逸去。 引起樣品變形的表面張力問題。常用液態(tài)CO2浸透樣品，然后在臨界成像立體感強(qiáng)，一般掃描電鏡分辨率為3nm。近年來研制的低壓高分辨掃描電鏡其分辨率可達(dá)0.7nm，可用于觀察核孔復(fù)合體等更精細(xì)結(jié)構(gòu)。瘧疾破壞的兩個紅細(xì)胞Scanning Tunneling Microscope, STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等。掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品

12、表面形貌信息、電特性或磁特性等。原理 裝置掃描的壓電陶瓷、逼近裝置、電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。三、掃描遂道顯微鏡1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，且分辨本領(lǐng)高（側(cè)分辨率為0.10.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）。2）可實(shí)時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息。3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察。特點(diǎn)納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。 用途 離心分離技術(shù) 細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法 特異蛋白抗原的定位與定性 細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 放射自顯影技術(shù) 定量細(xì)胞化學(xué)分析技

13、術(shù)第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法一、 離心分離技術(shù)用于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物。 破碎細(xì)胞：低滲勻漿、超聲波破碎、研磨等。 差速離心：利用不同離心速度分離密度不同的細(xì)胞組分。 密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離。 用途 基本操作過程二、 細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、 酶、糖與脂類等的顯示方法 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特性，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。 原理顯示DNA分布福爾根染色（Feulgen Stain）酸水解可除去RNA，僅保留DNA，并除去DNA上的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露的自由醛基與schiff試劑反

14、應(yīng)呈紫紅色。PAS反應(yīng)可確定多糖存在。原理是利用schiff試劑與醛基之間的反應(yīng)，但其醛基來自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用以證明脂肪滴存在。糖類顯色反應(yīng)脂類顯色反應(yīng)氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)呈紅色。檢測方法有多種氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸，形成有色復(fù)合物?？捎昧虼见}共價鍵的試劑進(jìn)行檢測。如檢測堿性磷酸酶可用格莫瑞（Gomori）方法。蛋白質(zhì)顯色反應(yīng)米倫（Millon）反應(yīng)重氮反應(yīng)蛋白質(zhì)-SH檢測酶檢測三、特異蛋白抗原的定位與定性快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)用：通過對分泌蛋白

15、的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。免疫熒光技術(shù)免疫電鏡技術(shù)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術(shù) （同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù) （生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合） PCR技術(shù)五、放射自顯影技術(shù)原理：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究。應(yīng)用：實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。 步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）； 放射自顯影。鴨瘟病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞24小時后，用3H尿嘧啶核苷脈沖標(biāo)記10分鐘的電鏡放射自顯影圖片。在病毒大量復(fù)制與裝

16、配的宿主細(xì)胞中，核仁（Nu）依然存在，并保持其轉(zhuǎn)錄功能 SG： 銀顆粒； N： 細(xì)胞核； Nu： 核仁； C： 細(xì)胞質(zhì)。 六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù) 細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry） 用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。主要應(yīng)用： 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞工程

17、第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞的培養(yǎng) 類型： 原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary culture cell） 繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culture cell） 細(xì)胞株（cell strain）: 正常二倍體，接觸抑制（是指細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時停止分裂的現(xiàn)象） 細(xì)胞系（cell line）： 亞二倍體，接觸抑制喪失動物細(xì)胞培養(yǎng) 首先從健康動物取出組織塊，剪碎，用胰酶或膠原酶與EDTA（螯合劑）等將細(xì)胞連接處消化分散，給予良好的營養(yǎng)液與無菌的培養(yǎng)環(huán)境（接近體溫與體內(nèi)pH）, 在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行靜止或慢速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。不論用何種培養(yǎng)液，一般都要加一定量的小牛血清，這樣才有利于細(xì)胞的貼壁

18、生長與分裂。 動物原代細(xì)胞培養(yǎng)步驟原代細(xì)胞（primary cell）傳代細(xì)胞（sub-culture cell） 將肌體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)。實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。 原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。用于傳代培養(yǎng)的稱為傳代細(xì)胞。 原代細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞生長出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，但有極少數(shù)細(xì)胞可能渡過“危機(jī)”而傳下去。這些存活的細(xì)胞一般又可順利地傳代40-50次，并且仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株（cell strain）： 由能進(jìn)行無限次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群稱為細(xì)胞系。

19、細(xì)胞系細(xì)胞與體內(nèi)原來的細(xì)胞比，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、遺傳上存在不同程度的變異。細(xì)胞系（cell line）： 細(xì)胞系細(xì)胞的特點(diǎn)是染色體明顯改變，一般呈亞二倍體或非整倍體，接觸抑制喪失，容易傳代培養(yǎng)。如Hela細(xì)胞系、BHK21細(xì)胞系、CHO細(xì)胞系等。Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)1、貼附型細(xì)胞（1）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞 細(xì)胞長梭形,核圓位中央,胞質(zhì)常外伸2-3個長短突起,多數(shù)細(xì)胞排列疏散,有較大細(xì)胞間隙,有時也相互平行排列，成群細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀等形式。（2）上皮型細(xì)胞 類似上皮細(xì)胞而故名。細(xì)胞扁平狀，排列較規(guī)則，貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平多角形，中央有偏圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細(xì)胞

20、，相互擁擠呈現(xiàn)“鋪路石塊狀”，局部可形成單層上皮“膜片組織”。（3）游走型細(xì)胞 在支持物分散生長，一般不連接成片形成群落；細(xì)胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動，速度快且方向不規(guī)則；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗吞噬顆粒；細(xì)胞外形不規(guī)則且多變，細(xì)胞密度增大連接成片時，形狀類似成纖維細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。（4）多形型細(xì)胞 常見形式：神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 細(xì)胞多形不規(guī)則。其不規(guī)則形態(tài)不象成纖維細(xì)胞那樣由胞質(zhì)突起所致，而是一般分胞體和胞突兩部分，胞突細(xì)長，胞體多形不規(guī)則。2、非貼附型細(xì)胞 細(xì)胞體外生長時不貼壁，在懸浮培養(yǎng)液中生長而故名，又稱懸浮型細(xì)胞。細(xì)胞呈球形。 常見形式：

21、血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。 培養(yǎng)時，細(xì)胞密度大，培養(yǎng)效率高，操作方便，易于大規(guī)模生產(chǎn)。 （1）單倍體細(xì)胞培養(yǎng)： 用花藥在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)?？梢詮男℃咦樱ㄐ坌陨臣?xì)胞）直接發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；也可通過愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長成植株。 （2）原生質(zhì)體培養(yǎng) （二倍體體細(xì)胞培養(yǎng)）： 用纖維素酶去掉細(xì)胞壁得到原生質(zhì)體，后者在無菌條件下生長分裂，經(jīng)誘導(dǎo)分化最終長成植株。也可通過不同植物的原生質(zhì)體進(jìn)行融合的體細(xì)胞雜交長成體細(xì)胞雜交植株。植物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合顯微注射等二、細(xì)胞工程細(xì)胞工程使用的主要技術(shù)有： 融合細(xì)胞（雜交細(xì)胞）在培養(yǎng)過程中會發(fā)生染色體丟失。 凡親本細(xì)胞親緣關(guān)系比較近的，連續(xù)培養(yǎng)中染色體丟失慢。人、鼠雜交細(xì)胞中，人的染色體丟失很快。細(xì)胞融合（cell fusion）與細(xì)胞雜交（cell hybridization）技術(shù) 兩個或多個細(xì)胞融合成一個雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象稱細(xì)胞融合。動物細(xì)胞融合：滅活病毒（如仙臺病毒） 聚乙二醇（PEG）植物細(xì)胞融合時先要用纖維素酶去掉纖維素壁。電融合技術(shù)：懸浮細(xì)胞在低壓交流電場 （100-200V/cm）中聚集成串珠狀細(xì)胞群或?qū)⑾嗷ソ佑|的單層培養(yǎng)細(xì)胞，加高壓脈沖促使融合。免疫小鼠獲得小鼠脾