生物化學與分子生物學實驗技術市公開課獲獎課件

1、第三章：層析技術第三章 層析技術第1頁第1頁 層析技術是利用混合物中各組分物理化學性質(分子形狀和大小、分子極性、吸附力、 分子親和力、分派系數(shù)等)不同，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，當流動相流過固定相時，各組分以不同速度移動，而達到分離技術。 層析技術操作簡便，樣品可多可少，既可用于試驗室研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)， 還可與其它分析儀器配合，組成各種自動分析儀器。 第2頁第2頁層析技術分類 (1) 按流動相狀態(tài)分類：用液體作為流動相稱為液相層析，或稱液相色譜；以氣體作為流動相稱為氣相層析，或稱氣相色譜。 (2) 按固定相使用形式分類：可分為柱層析(固定相填裝在玻璃或不銹鋼管中構成

2、層析柱) 、紙層析、薄層層析、薄膜層析等。 (3) 按分離過程所主要依據(jù)物理化學原理分類：可分為吸附層析、分派層析、離子互換層析、分子排阻層析、親和層析等。本章按第三種分類進行敘述。 第3頁第3頁第一節(jié) 吸附層析 吸附層析是利用吸附劑對不同物質吸附力不同而使混合物中各組分分離方法。 吸附層析在各種層析技術中應用最早，因為吸附劑起源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡樸 ，又含有一定分辯率等優(yōu)點，故至今仍廣泛使用。第4頁第4頁 凡能夠將其它物質匯集到自己表面上物質，都稱為吸附劑。能匯集于吸附劑表面物質稱為被吸附物。在吸附層析中應用吸附劑普通為固體。 固體內部分子所受分子間作用力是對稱，而固體表面分子所

3、受力是不對稱。 向內一面受內部分子作用力較大，而表面向外一面所受作用力較小，因而當氣體分子或溶液中溶質分子在運動過程中碰到固體表面時就會被吸引而停留在固體表面上。 吸附劑與被吸附物分子之間互相作用是由可逆范德華力所引起，故在一定條件下，被吸附物能夠離開吸附劑表面，這稱為解吸作用。 吸附層析就是通過連續(xù)吸附和解吸附完畢。本節(jié)主要簡介吸附柱層析和聚酰胺薄膜層析 ，薄層吸附層析將在本章第六節(jié)簡介，氣固吸附層析在第七節(jié)簡介。第5頁第5頁一、吸附柱層析 將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構成層析柱，層析時欲分離樣品自柱頂加入，當樣品溶液所有流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗過程稱為洗脫，加入溶劑稱為洗

4、脫劑。 第6頁第6頁第7頁第7頁 在洗脫過程中，柱內不停地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附過程。即被吸附物質被溶劑解吸而隨溶劑向下移動，又碰到新吸附劑顆粒被再吸附，后面流下溶劑又再解吸而使其下移動。經(jīng)過一段時間以后，該物質會向下移動一定距離。此距離長短與吸附劑對該物質吸附力以及溶劑對該物質解吸(溶解)能力相關。不同物質因為吸附力和解吸力不同 ，移動速度也不同。吸附力弱而解吸力強物質，移動速度就較快。經(jīng)過適當時間以后，不同物質各自形成區(qū)帶，假如被分離是有色物質話，就能夠清楚地看到色帶(色層)。 假如被吸附物質沒有顏色，可用適當顯色劑或紫外光觀測定位，也可用溶劑將被吸附物從吸附柱洗脫出來,再用適當顯

5、色劑或紫外光檢測，以洗脫液體積對被洗脫物質濃度作圖，可得到洗脫曲線。吸附柱層析成敗關鍵是選擇適當吸附劑、洗脫劑和操作方式。 第8頁第8頁(一) 吸附劑選擇 慣用吸附劑有極性和非極性兩種。羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石屬前者，活性炭屬后者。在實踐中無論選擇那種類型吸附劑，都應具備表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強和成本低廉等性能。 在選擇詳細吸附劑時，主要是依據(jù)吸附劑本身和被吸附物質理化性質進行。普通來說， 極性強吸附劑易吸附極性強物質，非極性吸附劑易吸附非極性物質。但是為了便于解吸附，對于極性大分離物，應選擇極性小吸附劑，反之亦然。抱負吸附劑必需通過多次試驗才干取得。 第9頁第9頁

6、羥基磷灰石 羥基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，簡稱HA吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質、酶、核酸、病毒和其它生命物質方面得到了廣泛應用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，通過一次HA柱層析，就能達到有效分離。 HACa2+基團和生物分子表面負電荷基團互相反應，在用HA分離生物分子過程中起著主要作用。而HAPO43-基團與生物分子表面正電荷基團互相反應，則僅起著次要作用。 第10頁第10頁使用HA作為固定相基質注意事項： (1) HA系干粉時，要先在蒸餾水中浸泡，使其膨脹度(水化后所占有體積)達到2-

7、3mL/克后，再按16體積加入緩沖液懸浮，以除去細小顆粒； (2) HA懸浮液須用旋渦振蕩器混合，若用磁棒或玻棒攪拌時，HA晶體結構會被破壞； (3) 忌用檸檬酸緩沖液和pH5.5緩沖液。當用過HA層析柱再生時，要先挖去頂部一層HA，然后用一倍床體積1mol/L NaCl溶液洗滌，接著用4倍床體積平衡液洗滌平衡，如此處理后即可使用； (4) 就操作容量來說，普通細顆粒HA比粗大。而從分辨率比較，粗顆粒HA也沒有細好。 用細顆粒HA層析時，柱子直徑應大些才干達到滿意流速。 第11頁第11頁2. 硅膠 是最慣用吸附劑，通慣用SiO2.xH2O表示，是含有硅氧交聯(lián)結構，表面有許多硅醇基多孔性微粒。硅

8、醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強吸附力。 水能與硅膠表面羥基結合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去水稱自由水，若自由水含量達17%以上，則吸附力極低，此時，硅膠只能用于分派層析。若將硅膠在105-110加熱30min ，吸附能力明顯增強，這一過程稱為活化。假如將硅膠加熱到500，硅醇基結構會變成硅氧烷結構，吸附能力明顯下降。 硅膠含有微酸性，適合用于分離酸性和中性物質，如有機酸、氨基酸、甾體等。 第12頁第12頁3.氧化鋁 分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、

9、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定甙類、酯類等化合物。 氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400高溫下加熱6h，使氧化鋁含水量在0%-3%之間， 可得到級或級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁內部結構。4.大孔吸附樹脂和聚酰胺近年用于中藥活性成份分離。 第13頁第13頁 (二) 洗脫滌選擇 洗脫劑指是溶解被吸附樣品和平衡固定相溶劑。適當洗脫劑應符合下列條件： 純度較高； 穩(wěn)定性好； 能較完全洗脫所分離成份； 黏度??； 易和所需要成份分開。 第14頁第14頁 洗脫劑可依據(jù)分離物中各成份極性、溶解度和吸附劑活性來選擇。普通蛋白質或核酸被極性強羥基磷灰石吸附后，要用含有鹽緩沖液洗脫。而甾體或色素等化合物

10、被極性較弱硅膠吸附后，則可用有機溶劑洗脫。所用洗脫劑濃度大小和極性強弱選擇，需通過試驗擬定。 在實踐中，選擇洗脫劑順序是由極性小到極性大(正向層析)。當把極性小洗脫劑換成極性大時，宜先將極性大和極性小洗脫劑混合使用，濃度則由低到高。總之，選取洗脫劑原則是能較完全地洗脫所要分離成份，并力爭用量少、洗脫時間短。 第15頁第15頁(三) 操作 柱層析設備主要有層析柱、部分搜集器、磁力攪拌器和恒流泵。有條件時，配備一臺檢測儀和一臺統(tǒng)計儀就構成一個完整層析系統(tǒng)。 1.層析柱 層析柱是下端有細口并帶有篩板玻管。柱直徑與長度之比，普通為110- 140。采用極細吸附劑裝柱時，宜用百分比大層析柱。反之，則宜用

11、百分比小層析柱。這樣有助于節(jié)約時間和提升分辨率。層析柱床體積是由吸附劑量和膨脹度決定。 第16頁第16頁2.吸附劑用量 吸附劑用量是依據(jù)其本身操作容量和分離物中各成份性質決定。當操作容量高時， 吸附劑用量少。普通吸附劑用量為被分離樣品30-50倍。若樣品中各成份性質相同難以分開時，則吸附劑用量應增大，有時不小于樣品100倍 第17頁第17頁3.裝柱 裝柱前要先將層析柱垂直固定在支架上。裝柱辦法分干裝法和濕裝法兩種。干裝法系直接加吸附劑到柱中，然后倒入溶劑。此法不易將氣泡排盡。而濕裝法系先加適量溶劑到柱內， 排走其中空氣，然后把預先用溶劑浸泡好吸附劑攪勻，隨后將此懸浮液連續(xù)傾入柱中， 待其自然沉

12、降至柱高1/4-1/3時打開柱下端口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液漸漸下降至需要高度。吸附劑表面要平整，應使其始終浸沒在溶劑中，嚴防氣泡產(chǎn)生。這種裝柱法對各種基質都合用。裝好層析柱應馬上與洗脫劑連接，在一定操作壓下(貯液器內液面與層析柱出口之間壓力差)，控制其流速，讓2-3倍柱體積洗脫劑流過固定相，使其達到平衡，也使固定相高度恒定或離子強度與洗脫劑一致。此時層析柱中基質應合乎填裝均勻、松緊一致和沒有氣泡原則。 第18頁第18頁4. 上樣和洗脫 通過平衡層析柱，當平衡液流到與固定相表面一致位置時，用滴管輕輕地把樣品溶液加到固定相表面，要盡也許避免沖動基質。加入樣品液體積普通應小于床體積1/2

13、(當加入樣品量相同時，體積越小越有利于提升分辨率)。待樣品液液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫劑(其體積用液面距固定相表面高度約5厘米計)，并在柱上端與裝有洗脫劑貯液瓶連接開始冼脫。同時在柱下端與部分搜集器接通，馬上進行分級搜集(按體積或時間分管搜集)。隨即將搜集每管溶液進行濃度或活性測定。依據(jù)測定結果，即可繪制出洗脫曲線(以管號或洗脫體積為橫坐標，以每管溶液中樣品濃度或活性為縱坐標，有適當檢測器和統(tǒng)計儀時，洗脫液流經(jīng)檢測器再搜集，用統(tǒng)計儀可自動繪制洗脫曲線。第19頁第19頁 抱負洗脫曲線如圖3-1所表示。圖中A峰和B峰均呈對稱形，兩者沒有重疊，這表明樣品液中組分已完全分開。層析峰面積(FE

14、G)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物依據(jù)。第20頁第20頁 為了取得滿意分離結果，洗脫液流速務必恰當控制。假如太快，洗脫物在兩相中平衡過程不完全；假如太慢，洗脫物會擴散。若峰與峰之間有重疊，宜減少洗脫劑強度，若峰間距離過大，或一些成份不能洗脫時，宜加大洗脫劑強度(極性)，成份復雜時，可采用洗脫劑由弱到強梯度洗脫(辦法見離子互換層析)。 由層析柱分離出樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進行純度測定。如雜質含量仍大時，應當用其它辦法繼續(xù)純化。 第21頁第21頁二、聚酰胺薄膜層析 聚酰胺薄膜(尼龍薄膜)層析是指樣品溶液隨流動相經(jīng)過聚酰胺薄膜時，因為聚酰胺與各極性分子產(chǎn)生氫鍵吸附能力

15、不同，而將各組分分離方法。 聚酰胺是由己二酸與己二胺聚合而成或由己內酰胺聚合而成高分子化合物。含有大量酰胺基團，其羰基可與含羥基物質形成氫鍵，其亞氨基又可與硝基化合物或醌類形成氫鍵，而產(chǎn)生吸附作用。不同物質因為形成氫鍵能力不同，故吸附力也不同，經(jīng)過吸附和洗脫就可達到分離目標。 第22頁第22頁 聚酰胺薄膜層析只適合用于極性分子分離。如，酚類、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸類物質等。尤其是在蛋白質化學結構分析中，氨基酸衍生物，如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等分析，靈敏度高，分辨力強，操作以便，速度較快。 洗脫時，洗脫劑取代被吸附物與聚酰胺形成氫鍵，而使被

16、吸附物解吸。 各種化合物與聚酰胺形成氫鍵能力主要由物質分子結構所決定。另外也與所使用溶液相關。普通用水作溶劑時形成氫鍵能力最強，故容易吸附，難于洗脫。在有機溶劑中形成氫鍵能力較弱，在堿性溶液中形成氫鍵能力最弱，因此洗脫劑最好選取堿性溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氫氧化鈉溶液或稀氨水等。 第23頁第23頁第二節(jié) 分派層析 分派層析是利用各組分分派系數(shù)不同而給予分離方法。 分派系數(shù)(K)是指一個溶質在兩種互不相溶溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑中濃度比值： K=固定相中溶質濃度/流動相中溶質濃度 分派系數(shù)與溶劑和溶質性質相關，同時受溫度、壓力影響。因此不同物質分派系數(shù)不同。而在恒溫恒

17、壓條件下，某物質在確定層析系統(tǒng)中分派系數(shù)為一常數(shù)。 在分派層析中，通慣用多孔性固體支持物如濾紙、硅膠等吸著一個溶劑作為固定相，另一個與固定相溶劑互不相溶溶劑沿固定相流動組成流動相，某溶質在流動相帶動下流經(jīng)固定相時，會在兩相間進行連續(xù)動態(tài)分派。當樣品中含有各種分派系數(shù)各不相同組分時，分派系數(shù)越小組分，隨流動相遷移越快。兩個組分分派系數(shù)差異越大，在兩相中分派 次數(shù)越多，越容易被徹底分離。 第24頁第24頁 紙層析屬于典型分派層析，且系統(tǒng)簡樸，使用以便，在生物化學發(fā)展中發(fā)揮過極其主要作用。本節(jié)主要通過紙層析簡介分派層析基本知識。 另外，將硅膠、硅藻土等鋪在玻璃或金屬板上進行層析可構成薄層層析系統(tǒng)，由

18、于薄層層析還可做吸附、離子互換等層析，將在本章第六節(jié)專門敘述，在硅藻土上吸附或化學鍵合一定溶劑，裝到層析柱上，以氣體為流動相可構成氣液分派層析，即氣相色譜系統(tǒng)，在硅膠等固體材料上吸附或化學鍵合一定溶劑，裝到層析柱中，用一定洗脫劑洗脫， 可構成液液分派層析，這種系統(tǒng)在高效液相色譜中應用普遍。 氣相色譜和高效液相色譜系統(tǒng)復雜，將在本章第七節(jié)和第八章專門簡介。 第25頁第25頁二、紙層析 (一) 原理 濾紙普通能吸取22%-25%水，其中6%-7%水是以氫鍵與濾紙纖維上羥基結合，普通情況下較難脫去。紙上層析實際上是以濾紙纖維結合水為固定相，而以有機溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動相。展開時，有

19、機溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質在兩相之間不停地進行分派。因為各物質有不同分派系數(shù)，移動速度因此不同，從而達到分離目標。 第26頁第26頁 溶質在濾紙上移動速率可用Rf值表示： Rf= a/ b式中a：溶質斑點中心移動距離 b：溶劑前沿移動距離 Rf值決定于被分離物質在兩相間分派系數(shù)以及兩相間體積比。因為在同一試驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，因此Rf值決定于分派系數(shù)。不同物質分派系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此能夠依據(jù)Rf值大小對物質進行定性分析。 第27頁第27頁(二) 影響Rf值主要原因 物質結構和極性 物質結構和分子極性是影響Rf值主要原因。極性較大物質，在水中溶解度較大，其Rf值就較小，

20、反之亦然。 2.濾紙 不同濾紙厚薄程度和纖維松緊度各不相同，因此結合水量不同，兩相體積比也就不同。因此同一個物質在不同型號濾紙上進行層析時，所得到Rf值也不相同。 另外，濾紙上所含雜質也會影響Rf值，必要時要進行預處理，以去除雜質影響。比如：可用0.01-0.4mol/LHCl處理濾紙，以除去濾紙上金屬離子，然后再用水洗至中性。 層析濾紙由高純度棉花制成。要求質地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，含有一定機械強度，并含有一定純度。國產(chǎn)新華濾紙、日本東洋濾紙等均經(jīng)常被采取。 第28頁第28頁3.層析所用溶劑 同一物質在不同溶劑系統(tǒng)中進行層析時，Rf值不同。因此溶劑配制和使用必須嚴格，才干使Rf值重

21、現(xiàn)性好。在好溶劑系統(tǒng)中被分離物質Rf值應在0.05-0.85之間，樣品中被分離組分Rf之差最好大于0.05。 溶劑系統(tǒng)中試劑若純度不夠，需經(jīng)過預處理后才干使用。處理方法因溶劑性質而異。常用處理方法有：酸、堿抽提，水洗滌，重蒸餾，脫水干燥等。舉比如下： (1) 苯酚：重蒸餾，收集180餾分。 (2) 乙酸：在冰醋酸中加入1%重鉻酸鉀，蒸餾，收集118餾分。 (3) 正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氫氧化鈉溶液洗滌，再用無水碳酸鉀脫水， 用磨口蒸餾器蒸餾，收集117餾分。 第29頁第29頁4.pH值 溶劑和樣品pH值會影響物質解離，從而影響物質極性和溶解度，使Rf值改變。溶劑酸

22、堿度增大則流動相含水量增高，使極性物質Rf值增長；反之則減少。 為了避免或減少pH值對Rf值影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定pH值，通過調整溶劑或樣品溶液pH值，使pH值保持恒定。 5.溫度 溫度能影響物質在兩相中溶解度，即影響分派系數(shù)；也影響濾紙纖維水合作用，即影響固定相體積；同時在多元溶劑系統(tǒng)中，溫度明顯地影響溶劑系統(tǒng)含水量，即影響流動相組分百分比。因此溫度改變使Rf值改變很大，為此，層析必須在恒溫條件下進行。 一些對溫度敏感溶劑系統(tǒng)，最好不要配成飽和溶液。如水飽和酚溶液，可改成酚水 41或51等。 第30頁第30頁6.展開方式 同一物質在其它層析條件完全相同情況下，用不同

23、展開方式進行層析時，所得到Rf 值不相同。用下行法展開時，Rf值較大；用上行法展開時，Rf值較小；用圓形濾紙層析時，因為內圈較外圈小，限制了溶劑流動，Rf值也較小。 7.樣品溶液中雜質 樣品溶液中存在雜質時，有時對Rf值有所影響。比如：氯化鈉存在會影響氨基酸Rf 值。 第31頁第31頁(三) 操作辦法 1.樣品處理 用作紙層析樣品，應盡也許除雜純化。調整到一定pH值，濃度太低可用真空濃縮提升濃度，濃度太高則需稀釋。 2.點樣 將濾紙裁成適當大小，用鉛筆在距邊線2cm左右劃一直線(稱為原線)，線上每隔2-3cm劃一圓點(稱為原點)。然后用點樣器(定性分析可用普通毛細管，定量分析需用血球計數(shù)管或微

24、量注射器)輕輕點在原點上。樣品點直徑約0.3-0.5cm。點樣量應依據(jù)紙長短以及樣品性質來決定，普通每一樣品量為5-30g。點樣普通采取少許多次，每點一次必須用冷風吹干，然后再點第二次。每次點樣位置應完全重合，不然會出現(xiàn)斑點畸形現(xiàn)象。 第32頁第32頁3.平衡 點樣以后展開以前先將濾紙與層析缸用配好溶液系統(tǒng)蒸汽來飽和，這個過程稱之為“平衡”。若不經(jīng)平衡，濾紙和層析缸未被溶劑蒸汽飽和，在層析過程中，濾紙會從溶劑中吸取水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，從而改變溶劑系統(tǒng)組成，嚴重時紙上會出現(xiàn)不同水平溶劑前沿，嚴重影響層析效果。平衡普通在密閉層析缸內進行。 第33頁第33頁4.展開 平衡結束后，將濾紙靠樣

25、品點一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm，此時即開始展開。當溶劑前沿抵達濾紙另一端0.5-1cm處時，展開結束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標識，晾干或用冷風吹干。 按溶劑在濾紙上流動方向不同，展開有上行、下行和環(huán)行三種方式。 (1) 上行法：將濾紙點樣一端向下浸入溶劑中，溶劑因毛細管引力作用從下向上流動。 上行法操作簡樸，重現(xiàn)性好，是最慣用展開方法，但展開時間較長。 (2) 下行法：在層析缸上部有一盛展開劑液槽，將濾紙點樣一端朝上浸入槽中，溶劑主要靠重力作用自上而下流動。下行法展開速度快，但Rf值重現(xiàn)性較差，斑點易擴散。 第34頁第34頁 (3) 環(huán)行法：又稱水平法，樣品點于圓形濾紙距圓

26、心1cm左右環(huán)形線(原線)上。濾紙水平放置，溶劑由濾紙條引向圓心，然后不斷向四周水平方向流動。由于溶劑向圓周方向擴散，因此展開圖譜呈弧形。用環(huán)行法展開時，最好使用無方向性特制濾紙。如東洋51UH濾紙等。 （4）雙向展開法：假如樣品組分較多，用一個溶劑系統(tǒng)（常為酸性）不能將各組分所有分開時，可將樣品點在方形濾紙一角，用一個溶劑系統(tǒng)展開后吹干溶劑，將濾紙轉動90o后再用另一個溶劑系統(tǒng)（常為堿性）展開，這稱為“雙向展開法”。 第35頁第35頁5.顯色 為了顯示層析斑點位置，可依據(jù)物質性質不同，采取顯色劑顯示或紫外光顯示。 (1) 顯色劑顯示： 被分離物質與顯色劑生成有顏色化合物，顯示斑點位置。慣用噴

27、霧法 、浸漬法或涂刷法。 (2) 紫外光顯示：有些物質有紫外光吸取性質，如核苷酸類物質。有些物質受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生素B1、B2等，因此可在紫外光照射下觀測到被分離物質斑點。 6.定性分析 層析后斑點顯示出來后，計算出各斑點Rf值，就能夠對物質進行定性。 第36頁第36頁7.定量分析 對被分離物質進行定量辦法諸多，慣用有： (1) 剪洗比色法：將斑點剪下，用適當溶劑洗脫后，通過度光光度計進行比色定量。 (2) 直接比色法：用特制分光光度計直接測量濾紙上斑點顏色濃度，畫出曲線，由曲線所包括面積可求出待測物含量。 (3) 面積測量法：試驗證實，圓形或橢圓形斑點面積與物質含量對數(shù)成正比。因

28、此，可用測量斑點面積辦法求得物質含量。 第37頁第37頁第38頁第38頁第三節(jié) 凝膠層析 凝膠層析，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質相對分子質量不同而達到物質分離一個層析技術。其設備簡樸，操作方便，不需要再生處理即可重復使用，適合用于不同相對分子質量各種物質分離，已廣泛地用于生物化學、生物工程和工業(yè)、醫(yī)藥等領域。 一、基本原理 當含有各種組分樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒微孔，沿凝膠顆粒間隙以較快速度流過凝膠柱。而小分子物質能夠進入凝膠顆粒微孔中，向下移動速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質量從大到小順

29、序先后流出層析柱，而達到分離目的。第39頁第39頁第40頁第40頁 樣品中各組分流出順序，可用分派系統(tǒng)Ka來量度： Ka=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：為洗脫體積(elution volume)，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時，所需洗脫液體積； Vo：外體積(outer volume)，為層析柱內凝膠顆粒之間空隙體積； Vi：內體積(inner volume)，為層析柱內凝膠顆粒內部微孔體積。 當某組分Ka=0時(即Ve=Vo)，闡明該組分完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出； 若某組分Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時，闡明該組分可自由地擴散進入凝膠顆粒內部微孔中，洗脫時，最后流出

30、； Ka在0-1之間組分，洗脫時Ka值小先流出 ，Ka值大后流出。 第41頁第41頁 上述內體積Vi能夠從凝膠干重和吸足水后濕重求得，也可用小分子物質(如(NH4)2SO4,NaCl等)實際測量而得到(Vo+Vi)。 外體積Vo可用相對分子質量很大物質溶液(如血紅蛋白、印度黑墨水、相對分子質量為200萬藍色葡聚糖-、鐵蛋白等)通過實際測量求出。也能夠從下式間接計算， Vo=Vt-Vi-Vg 式中 Vg：凝膠基質本身體積；Vi：內體積；Vt：層析柱內凝膠床總體積。 Vt可通過測量柱內徑和凝膠床高度計算出來，即 Vt=（1/4）R2h 洗脫體積Ve可通過加進某一組分后實際測量而得，也能夠在已知Ka

31、后計算出來。即 Ve=Vo+KaVi 第42頁第42頁 在普通情況下，凝膠對組分沒有吸附作用。當洗脫液體積等于Vo+Vi時，所有組分都應當被洗脫出來，即Ka最大值為1。然而在某種情況下Ka值會不小于1。這種反?，F(xiàn)象闡明這一層析過程不是單純凝膠層析，其中也許還夾雜有吸附或離子互換等過程。 對于同一類型化合物而言，組分洗脫體積Ve與相對分子質量(Mr)關系可用下式表示： Ve=K1- K2lgMr 式中K1，K2為常數(shù)。 第43頁第43頁 若以組分洗脫體積(Ve)對組分相對分子質量對數(shù)(lgMr)作圖，可得一曲線，其中主要部分成直線關系。以此為原則曲線，能夠通過測定某一未知組分洗脫體積，而從原則曲

32、線中查得其相對分子質量。在實際應用中多以相對洗脫體積Kav (Kav=Ve/Vt) 對lgMr作曲線，稱為選擇曲線，曲線斜率闡明凝膠特性。每一類型化合物，如球蛋白類、右旋糖酐類、酶與清蛋白類等都有各自特定選擇曲線。測定期，未知相對分子質量組分應位于直線部分。若不在直線部分，可選取另一個凝膠重新試驗。 第44頁第44頁 二、凝膠選擇 凝膠種類諸多，其共同特點是內部含有微細多孔網(wǎng)狀結構，其孔徑大小與被分離物質相對分子質量大小有相應關系。慣用有： (1) 聚丙烯酰胺凝膠 是一個人工合成凝膠，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)與甲叉雙丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2

33、)共聚而成。 商品名稱為生物膠P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝膠是完全惰性，適宜于各種蛋白質、核苷及核苷酸等分離純化。缺點是遇強酸時酰胺鍵會水解，普通在pH2-11范圍內使用。 第45頁第45頁 (2) 葡聚糖凝膠 由相對分子質量為4 104-20 104葡聚糖交聯(lián)聚合而成。由Pharmacia (GE)公司生產(chǎn)商品名為Sephadex葡聚糖凝膠，含有良好化學穩(wěn)定性等長處，為最慣用凝膠之一。Sephadex耐堿，在0.01mol/L鹽酸中放置六個月不受影響，故廣泛用于各種物質分離純化。 Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等各種型號、和粗、

34、中、細、超細各種規(guī)格，G后面數(shù)字越大，膠粒內孔經(jīng)越大，越適合于大分子分離，但顆粒 機械強度隨孔經(jīng)增大而減少，較高操作壓會使G75、G100、G150、G200等顆粒變形而使洗脫液流速下降，故用上述型號Sephadex進行層析時，流速慢，時間長。同型號Sephadex，顆粒越細，在同樣柱長柱子中分辨力越好，但流速也越慢。 第46頁第46頁 (3) 瓊脂糖凝膠 從瓊脂中除去帶電荷瓊脂膠，可制成不帶電荷瓊脂糖，用瓊脂糖制成顆粒內孔徑不等各種型號層析用瓊脂糖凝膠，商品為Sepharose。Sepharose孔經(jīng)大，機械強度好，層析時流速較快，但只能分離相對分子質量較大分子。 近年Pharmacia (

35、GE)公司推出商品名為Supersose瓊脂糖凝膠，主要有含瓊脂糖6%Superose6 和含瓊脂脂糖12%Superose12 及其衍生物。Superose剛性特好，理化穩(wěn)定性高，在高黏度液體(如8mol/L尿素)下能保持較好流速，適合于糖類、核酸、病毒和包括體蛋白在促溶劑中純化。 第47頁第47頁 4.聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠 商品名Sephacryl，是由甲撐雙丙烯酰胺交聯(lián)丙烯葡聚糖形成球形凝膠顆粒，反壓尤其低，機械性能好，分離速度快，分辨率高，理化穩(wěn)定性好，在SDS、6mol/L鹽酸胍及8mol/L尿素中均可使用。有S-100HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S- 50

36、0HR、S-1000SF6種型號，可分離相對分子質量1 103-1 108 蛋白質，亦可用于分離多糖和核酸。 第48頁第48頁 5.Superdex Pharmarcia公司提供新型凝膠過濾介質，是將葡聚糖共價結合到交聯(lián)多孔瓊脂糖珠體上制成球形凝膠珠，流速快、反壓低、非特異性吸附很低，因而樣品回收率很高，是當前分辨率和選擇性最好凝膠過濾介質。理化穩(wěn)定性很高，在0.1mol/L HCl及0.1 mol/L NaOH中40保溫400小時分辨力保持不變，在1% SDS、8mol/L尿素及6mol/L鹽酸胍中均能保持良好色譜性能，有各種型號可供選擇，適合于生物大分子精細純化。 第49頁第49頁三、操作

37、 層析柱普通內徑1-4cm，柱長10-150cm，裝柱辦法同吸附柱層析。 加樣辦法同吸附柱層析，樣品液濃度大些為好，但黏度不能過大，樣品體積普通為柱體積1%-10%。凝膠柱平衡和洗脫普通用同一個溶液，洗脫液無特殊要求，普通選擇使樣品穩(wěn)定緩沖液。洗脫液流速要穩(wěn)定，分離蛋白質和核酸時，慣用輸液泵、柱、檢測器、分部搜集器、統(tǒng)計儀構成層析系統(tǒng)，要通過試驗合理調整流速、檢測器和統(tǒng)計儀靈敏度， 統(tǒng)計儀走紙速度，才干取得良好洗脫曲線。若峰有重疊，宜加長柱子，減少流速，若峰間距離過大，峰過寬，宜縮短柱子，加快流速，減少走紙速度。峰過高，可減少加樣量，或減少檢測器和統(tǒng)計儀靈敏度。峰過低則需加大靈敏度，或加大加樣

38、量。 凝膠暫時不用時，可加少許防腐劑如0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰預防染菌。用過凝膠可加熱滅菌后低溫保留或用20%左右乙醇保留。 第50頁第50頁 一、基本原理 離子互換劑是由基質、電荷基團(或功效基團)和反離子構成，基質與電荷基因以共價鍵連 接，電荷基因與反離子以離子鍵結合。 離子互換劑與水溶液中離子或離子化合物反應主要以離子互換方式進行，假設以RA+代表陽離子互換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中陽離子B+發(fā)生可逆互換反應，反應式為：RA+B+ RB+A+ 第四節(jié) 離子互換層析 離子互換層析是在以離子互換劑為固定相，液體為流動相系統(tǒng)中進行。此法廣泛應用于諸多生化物質(比如氨基酸

39、、多肽、蛋白質、糖類、核苷和有機酸等)分析、制備、純化，以及溶液中和、脫色等方面。第51頁第51頁第52頁第52頁 離子互換劑對溶液中不同離子含有不同結合力，這種結合力大小是由離子互換劑選擇性決定。強酸性(陽性)離子互換劑對H+結合力比對Na+?。粡妷A性(陰性)離子互換劑對OH-結合力比對Cl-小得多；弱酸性離子互換劑對H+結合力遠比對Na+大；弱堿性離子互換劑對OH-結合力比對Cl-大。因此，在應用離子互換劑時，采取何種反離子進行電荷平衡是決定吸附容量主要因子之一。離子互換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成)結合力與離子電荷量成正比，而與水合離子半徑平方成反比。因此，離子價數(shù)越

40、高，結合力越大。在離子間電荷相同時，則離子原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結合力亦越大。第53頁第53頁 兩性離子如蛋白質、酶類、多肽和核苷酸等物質與離子互換劑結合力，主要取決于它們物理化學性質和在特定pH條件下展現(xiàn)離子狀態(tài)。當pH低于等電點(pI)時，它們帶正電荷能與陽離子互換劑結合；反之，pH高于pI時，它們帶負電荷能與陰離子互換劑結合 。pH與pI差值越大，帶電量越大，與互換劑結合力越強。 離子互換層析之因此能成功地把各種無機離子、有機離子或生物大分子物質分開，其主要依據(jù)是離子互換劑對各種離子或離子化合物有不同結合力。 第54頁第54頁第55頁第55頁氨基酸離子互換分離原理第56頁第56

41、頁氨基酸分離過程第57頁第57頁二、離子互換劑 離子互換劑應滿足基本條件有： 有高度不溶性。即在各種溶劑中不發(fā)生溶解； 有疏松多孔結構或巨大表面積，使互換離子能在互換劑中進行自由擴散和互換； 有較多互換基團； 有穩(wěn)定物理化學性質。在使用過程中，不因物理或化學因子改變而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。 第58頁第58頁(一) 離子互換劑種類 依據(jù)離子互換劑中基質組成和性質，可將其分成兩大類： 1. 疏水性離子互換劑 疏水性離子互換劑中基質是人工合成、與水結合力較小樹脂。慣用樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成聚合物，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑，能把聚乙烯苯直鏈化合物連接成類似海綿狀結構，在此結構中以共價鍵引入不同電荷基

42、團。離子互換樹脂以電荷基團性質分則有：陽離子互換樹脂、陰離子互換樹脂(分別包含強、中、弱三種電荷基團)和螯合離子互換樹脂(對金屬離子有較強選擇性)。 第59頁第59頁 (1) 陽離子互換劑 陽離子互換劑電荷基團帶負電，反離子帶正電。因此，能夠與溶液中正電荷化合物或陽離子進行互換反應。依據(jù)電荷基團強弱，又可將陽離子互換劑分為強酸型( 帶磺酸基團)、中強酸型(帶磷酸基團或亞磷酸基團)和弱酸型(帶羧基或酚基)三種。 (2) 陰離子互換劑 陰離子互換劑是在樹脂中分別引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺 -NHCH3和伯胺-NH2基團構成。當引入季胺和叔胺基團時，分別為強陰性和中強陰性離

43、子互換劑。當引入仲胺和伯胺基團時，為弱陰性離子互換劑。 第60頁第60頁 樹脂型離子互換劑普通都呈網(wǎng)絡結構珠狀體，其大小在20-50目之間。近年Bio-Rad公司還制造了50-100目、100-200目以及200-400目的產(chǎn)品，目數(shù)大樹脂對提升分辨率和互換容量是有利。 疏水性離子互換劑由于含有大量活性基團，互換容量高、機械強度大、流動速度快。因此，主要用于分離無機離子、有機酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質，另一方面可用于從蛋白質溶液中除去表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)、清潔劑(如tritonX-100)、尿素、兩性電解質(Ampholyte)。另外，還可用于分離一些不易變性蛋白質。 第6

44、1頁第61頁疏水性離子互換劑對帶電荷多和疏水性強被分離物有較強截留能力。陽離子互換樹脂對氨基酸分離第62頁第62頁 2.親水性離子互換劑 這類互換劑與水親和力較大，載體孔徑大，適合于分離生物大分子，有各種類型： (1) 纖維素離子互換型 以纖維素為基質，慣用功效基因有磷酸基(P.中強酸型)、磺酸乙基(SE，強酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，強堿型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱堿型)、氨基乙基(AE，中檔堿型)、三乙醇基氨基(ECTE，中檔堿型)等，可制成纖維狀、微粒、短纖維、球形四種類型，Pharmacia (GE)公司生產(chǎn)DEAE-Sephacel為球形顆粒，機械性

45、能和理化穩(wěn)定性好，對蛋白質、核酸、激素等都有良好分辨率、回收率和互換容量，使用簡樸以便，在生物化學與分子生物學中使用普遍。另外，Watman公司DE-、CM-、P- 、AE-、SE-及QA-纖維素，Bio-Rad公司CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些國產(chǎn)DEAE-纖維素和CM-纖維素也可選擇使用。 第63頁第63頁 (2) 葡聚糖系離子互換劑 以SephadexG25和G50為基質，分別引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱堿型)、CM、SP(磺丙基、強酸型)等功效基因，構成8種互換劑，互換容量較離子互換纖維素大，除離子互換作用外，尚有分子

46、篩作用，但層析時床體積隨洗脫劑離子強度增長而縮小，以SephadexG50為基質互換劑尤其明顯，為使用帶來不便。 第64頁第64頁 (3) 瓊脂糖系列離子互換劑： 以瓊脂糖為基質，主要有Pharmacia (GE)公司Sepharose和Bio-Rad公司Bio-gel兩個系列。 Sepharose系列離子互換劑：早期產(chǎn)品為DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B ，對生物大分子分辨力好，互換容量大，床體積隨洗脫液離子強度和pH改變小，使用較 Sephadex系列以便。后續(xù)產(chǎn)品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化穩(wěn)定性和機

47、械性能更加好。互換容量大，能夠在床清洗，床體積隨pH離子強度改變很小，由于流速和載量高，適合于進行大量粗產(chǎn)品純化工作。引入功效機團有Q(強堿性)、SP、DEAE、CM四種。另外，Sepharose High Performnce (Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP兩種，顆粒細、分辨率高，理化穩(wěn)定性好，流速和載量均適合于試驗室或大量制備使用。 Bio-GelA系離子互換劑：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA兩種，回收率極高，床體積隨pH和離子強度改變小，pH和化學穩(wěn)定性好。 第65頁第65頁 (4) Source系列離子互

48、換劑 有Q(強堿型)和S(強酸型)兩種，是低壓層析系統(tǒng)中分辨率最高，流速最快離子互換劑，理化穩(wěn)定性極好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用壽命長 ，樣品回收率高，重復性好，工藝放大容易。 (5) Mono Beads系列離子互換劑 是Pharmacia (GE)公司推出新型互換劑，以親水性聚醚為基質 ，能快速分離蛋白質，肽和低聚核苷酸，動態(tài)載樣量大，可分離從mg到g單克隆抗體。 第66頁第66頁(二) 離子互換劑選擇 任何一個離子互換劑都不也許適合用于分離所有樣品。因此，選擇抱負離子互換劑是提升有效成份得率和分辨率一個主要環(huán)節(jié)。 1.陰、陽離子互換劑選擇 假如被分離

49、物質帶正電荷，應選擇陽離子互換劑；假如被分離物質帶負電荷，則應選擇陰離子互換劑；假如被分離物質為兩性離子，要按照其穩(wěn)定狀態(tài)凈電荷來選擇互換劑。假設一蛋白質等電點為5，若該物質在pH5-8穩(wěn)定期，應選擇陰離子互換劑； 若該物質在pH5下列穩(wěn)定期，則可選擇陽離子互換劑。 2.強、弱離子互換劑選擇 普通來說，強離子互換劑合用pH范圍很廣。因此慣用它來制備無離子水和分離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定物質。而弱性離子互換劑合用pH范圍較窄，在pH為中性溶液中互換容量也高，用于分離生物大分子物質時，其活性不易喪失。因此，分離生物樣品多采用弱離子互換劑。 第67頁第67頁 3.反離子選擇 離子互換劑處于電

50、中性時往往帶有一定反離子。為了提升互換容量，普通應選擇結合力較小反離子。所此，強陽性和強陰性離子互換劑應分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子互換劑應分別選擇Na型和Cl型。 4.基質選擇 樹脂基質是疏水性化合物，而纖維素、葡聚糖和瓊脂糖基質則是親水性化合物。在分離生物大分子時，親水性基質互換容量高，且對生物大分子物質吸附和洗脫都比較溫和，被分離物質活性不易受到破壞。 要恰當?shù)剡x擇離子互換劑，必須對被分離物性質和所處溶液組分及酸堿度等原因進行全面分析 。綜合考慮上述4個方面，選擇離子互換劑才干成功地分離樣品。 第68頁第68頁三、操作 1.離子互換劑處理、再生和轉型 取適量固體離子互換劑先用

51、水浸泡，待充足膨脹后加大量水懸浮除去細顆粒，爾后改用酸堿浸泡，以便除去雜質和使其帶上需要反離子。疏水性離子互換劑能夠用2-4倍2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液處理；而親水性離子互換劑則只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl處理(室溫下處理30分鐘) 。酸堿處理順序決定了離子互換劑攜帶反離子類型。在每次用酸(或堿)處理后，均應先用水洗滌至近中性，再用堿(或酸)處理。末了用水洗滌至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱。 第69頁第69頁 使用過離子互換劑，可采用一定辦法使其恢復本來性狀，這一過程叫做再生。再生能夠通過上述酸、堿重

52、復處理完畢，但有時也能夠通過轉型處理完畢。所謂轉型是指離子互換劑由一個反離子轉為另一個反離子過程。比如，欲使陽離子互換劑轉成鈉型時，則需用NaOH處理；欲使其轉成氫型時，則需用HCl處理；欲使其帶銨離子時，則需用NH4OH或NH4Cl處理。 長期使用過樹脂含有諸多雜質，欲將其除掉，應先用沸水處理，然后用酸、堿處理。用熱稀酸、稀堿處理效果更加好。樹脂若含有脂溶性雜質時，可用乙醇或丙酮處理。而長期使用過親水性離子互換劑處理普通只用酸、堿浸泡即可。原則上講，清除雜質過程應在不破壞離子互換劑結構和穩(wěn)定性，不影響其原有互換容量前提下進行 。 第70頁第70頁 2.緩沖液選擇 離子互換劑不但能夠與被分離物

53、進行互換，并且還能夠與緩沖液中離子進行互換。因此，離子互換劑吸附被分離物量與緩沖液pH值和離子濃度有密切關系。 起始緩沖液pH值和離子強度要能使樣品中有效成份與離子互換劑結合，而雜質與互換劑不結合，則pH值普通比有效成份pI高一個單位(用陰離子互換劑)或低一個單位(用陽離子互換劑)，離子強度為0.1時，就可不久地把有效成份與雜質分開?；蛘哌x擇起始緩沖液離子強度和pH值，使有效成份與離子互換劑結合得不牢固，而雜質與離子互換劑結合得牢固，也能得到高純度有效成份。選取洗脫液，其離子強度和pH值應使有效成份從離子互換劑上解離下來，普通離子強度要比起始緩沖液高，pH值要按離子互換劑性質來選擇。 第71頁

54、第71頁 3.被分離物質互換 使用離子互換劑辦法有兩種：一個是柱層析法，也叫動態(tài)法，即將離子互換劑裝入層析柱內，讓溶液連續(xù)通過。該法互換效率高，應用范圍廣；另一個是分批法，也叫靜態(tài)法，即將離子互換劑置入盛溶液容器內緩慢地攪拌。該法互換率低，不能連續(xù)進行，但是，需要設備簡樸，操作容易。 柱層析法裝柱操作和要求與吸附柱層析相同。離子互換劑總用量要依據(jù)其互換容量和待吸附物質總量(包括連續(xù)使用所有量)來計算。當溶液含有各種雜質時，必須考慮使互換量留有充足余地，實際互換量只能按理論互換量25%-50%計算。在樣品純度極低，或有效成份與雜質性質相同時，則實際互換量應控制得更低些。層析柱高與直徑百分比普通要

55、不小于101，分離樣品成份復雜時，百分比宜高一些，用于樣品濃縮和脫鹽時，百分比可低一些。 第72頁第72頁 4.被分離物質洗脫與搜集 在離子互換層析過程中，慣用梯度溶液進行洗脫，而溶液梯度則是由鹽濃度或酸堿度改變形成。 梯度溶液按組成來分，普通有二種：一個是增加離子強度梯度溶液。是用一簡樸鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成，習慣上不用弱酸或弱堿鹽類；另一個是改變pH 值梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量緩沖液制成，所用緩沖液種類、pH值以及緩沖容量要認真選擇，不然將達不到預期目標。對于增加離子強度梯度溶液，不論用于何種類型離子互換劑，其離子強度絕大部分是增加。而改變pH值

56、梯度溶液則不然，假如使用是陽離子互換劑，pH值應從低到高遞增；假如使用是陰離子互換劑，pH值應從高到低遞減，實際許可pH值范圍由待分離物質穩(wěn)定pH范圍和離子互換劑限制pH范圍來決定。 第73頁第73頁梯度形成能夠借助梯度混合器K=VM/VR第74頁第74頁 洗脫液離子強度和酸堿度改變速率會影響層析效果。當被分離物之間選擇系數(shù)相差較小時，洗脫液離子強度或酸堿度改變速度小些，有助于分辨率提升，但各組分峰形過寬時，可通過適當增長梯度斜率來克服。若各組分選擇系數(shù)差別大，有些組分不易洗脫時，洗脫液離子強度或酸堿度改變率要大些。 經(jīng)洗脫流出來溶液可用部分搜集器分部搜集，每管體積普通以柱體積1-2%為宜。

57、減少分部搜集體積，可提升分辨率。分部搜集溶液通過檢測分析，便可得知所含物質數(shù)量。以此為縱坐標，以相應洗脫體積為橫坐標，能繪制出洗脫曲線。若被分離物能夠用適當檢測器檢測，則可使洗脫液流經(jīng)檢測器比色池，用統(tǒng)計儀繪制洗脫曲線，如蛋白質和核酸可用紫外檢測器分別檢測A280或A260 第75頁第75頁第五節(jié) 親和層析 親和層析是利用生物分子間所含有專一而又可逆親和力而使生物分子分離純化層析技術。 含有專一而又可逆親和力生物分子是成對互配。主要有：酶和底物、酶與競爭性克制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結合蛋白等。 在成對互配生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液

58、中另一方分子進行親和層析，達到分離純化目的。比如，酶與其輔酶是成對互配，既可把輔酶作為固定相，使樣品中酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中輔酶分離純化。 第76頁第76頁親和層析示意圖第77頁第77頁 一、配基與偶聯(lián)凝膠選擇與處理 在親和層析中，作為固定相一方稱為配基(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix) (又稱載體或擔體)上，慣用載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。 當用小分子作為配基時，因為空間位阻不易與載體偶聯(lián)，或不易與配對分子載體結合。為此通常在載體和配基之間接入不同長度連接臂(space arm)。 偶聯(lián)時，必須首先使載體活化。即經(jīng)過

59、某種方法(如溴化氰法、疊氮法等)為載體引入某一活潑基團。 第78頁第78頁 活化載體(包括帶連接臂)已有商品發(fā)售。Pharmacia公司出產(chǎn)偶聯(lián)凝膠(coupling gel)能夠很簡樸地與所需配基偶聯(lián)，不需要特殊設備和復雜化學反應。慣用有： (1) 溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B (CNBr-activated sepharose 4B)：通過自發(fā)反應可安全 、簡便、快速地與含有伯胺基配基偶聯(lián)。 (2) 氨基瓊脂糖凝膠4B (AH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6) 長度連接臂，可與含有羧基配基偶聯(lián)。 (3) 羧基瓊脂糖凝膠4B (CH-sepharose 4B)：含有六碳 (C6)

60、長度連接臂，可與含有氨基配基偶聯(lián)。 (4) 活化羧基瓊脂糖凝膠 4B (Activated CH-sepharose 4B)：含有六碳連接臂和一個活化酯化基團，可自發(fā)地與含有氨基配基偶聯(lián)。 (5) 環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠 6B (Epoxy-activated sepharose 6B)：含有一條長親水連接臂，可與含有羥基、氨基或巰基配基偶聯(lián)。 (6) 活化巰基瓊脂糖凝膠 4B (Activated Thiolsepharose 4B)：含有一分子谷胱甘肽作為連接臂，可與含有游離巰基蛋白質配基可逆偶聯(lián)。 (7) 巰丙基瓊糖凝膠 6B (Thiopropyl sepharose 6B)：含有一個較短