酶的化學(xué)修飾市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、退出 Enzyme Engineering酶工程第1頁(yè)第1頁(yè)第五章 酶化學(xué)修飾第一節(jié) 概述 第二節(jié) 酶分子化學(xué)修飾辦法學(xué) 第三節(jié) 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾 第四節(jié) 有機(jī)大分子對(duì)酶修飾 第五節(jié)金屬離子置換修飾及物理修飾第六節(jié) 酶化學(xué)修飾應(yīng)用 第2頁(yè)第2頁(yè)第一節(jié) 概述 一、 概念二、 進(jìn)行化學(xué)修飾原因三、 化學(xué)修飾基本原理四、 修飾酶特點(diǎn) 第3頁(yè)第3頁(yè)一、概念 酶化學(xué)修飾 利用各種修飾劑含有化學(xué)基團(tuán)，與酶分子上某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶一些特性和功效技術(shù)修飾酶 在體外用一定化學(xué)辦法將酶和一些試劑進(jìn)行共價(jià)連接后而形成酶體外改造第4頁(yè)第4頁(yè)二、 進(jìn)行化學(xué)修飾原因穩(wěn)定性不

2、夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)需要作用最適條件不符，活性不高臨床應(yīng)用特殊要求：也許含有抗原性第5頁(yè)第5頁(yè)三、 化學(xué)修飾基本原理1、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象穩(wěn)定性與耐熱性2、如何保護(hù)酶活性部位與抗克制劑3、如何維持酶功效結(jié)構(gòu)完整性與抗蛋白 水解酶4、如何消除酶抗原性及穩(wěn)定酶微環(huán)境第6頁(yè)第6頁(yè)四、 修飾酶特點(diǎn)1、熱穩(wěn)定性增長(zhǎng)2、增長(zhǎng)抗克制劑、抗蛋白水解酶能力，體 內(nèi)半衰期延長(zhǎng)3、消除了酶抗原性4、微環(huán)境穩(wěn)定性增強(qiáng)，最適pH改變5、酶學(xué)性質(zhì)改變第7頁(yè)第7頁(yè)第一節(jié)結(jié)束概念進(jìn)行化學(xué)修飾原因 化學(xué)修飾基本原理修飾酶特點(diǎn)第8頁(yè)第8頁(yè)第一節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回 第9頁(yè)第9頁(yè)第二節(jié) 酶分子化學(xué)修飾辦法學(xué) 一、 修飾需考慮問題二、 選擇

3、酶分子修飾劑三、 修飾反應(yīng)普通程序四、 測(cè)定修飾程度和修飾部位五、 酶修飾辦法第10頁(yè)第10頁(yè)一、 修飾需考慮問題1、 酶性質(zhì)理解 (1) 酶活性部位情況 (2) 酶穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件 (3) 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活 潑性等第11頁(yè)第11頁(yè)一、 修飾需考慮問題2、 選擇反應(yīng)條件 (1) 反應(yīng)體系中酶與修飾劑分子百分比 (2) 反應(yīng)體系溶劑性質(zhì)，pH條件和離子強(qiáng)度 (3) 反應(yīng)溫度及時(shí)間 (4) 其它第12頁(yè)第12頁(yè)二、 選擇酶分子修飾劑修飾劑須具備特性1、 能選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)2、 反應(yīng)在確保酶蛋白不變性條件下進(jìn)行 3、 被標(biāo)識(shí)殘基在肽中穩(wěn)定，容易通過降解分離 出來并鑒

4、定4、 反應(yīng)程度能用簡(jiǎn)樸技術(shù)測(cè)定第13頁(yè)第13頁(yè)二、 選擇酶分子修飾劑修飾劑選擇1、 修飾劑相對(duì)分子質(zhì)量、修飾劑鏈長(zhǎng)度對(duì)蛋 白質(zhì)吸附性2、 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)數(shù)目及位置3、 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)活化辦法與條件第14頁(yè)第14頁(yè)三、 修飾反應(yīng)普通程序修飾反應(yīng) 終止 稀釋 陽(yáng)離子互換 洗滌 過濾 干燥第15頁(yè)第15頁(yè)三、 修飾反應(yīng)普通程序注意事項(xiàng)修飾后需進(jìn)行總氨基酸分析各種酶分子，修飾后均需對(duì)每個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行擬定注意緩沖液成份或修飾副產(chǎn)物對(duì)修飾部位和修飾程度及對(duì)酶活性影響修飾后酶性質(zhì)改變第16頁(yè)第16頁(yè)四、 測(cè)定修飾程度和修飾部位修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)原因1、 有多少修飾劑已結(jié)合到酶分子上2、 哪些氨基酸被修飾，

5、修飾度是多少3、 有多少種不同形式修飾劑酶分子耦合物， 每種各有多少4、 表面修飾、內(nèi)部修飾 測(cè)定方法第17頁(yè)第17頁(yè)五、 酶修飾辦法側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾大分子結(jié)合修飾其它(金屬離子置換修飾、物理修飾)第18頁(yè)第18頁(yè)第二節(jié)結(jié)束酶分子性質(zhì)理解選擇酶分子修飾劑選擇反應(yīng)條件修飾反應(yīng)要注意其它問題修飾反應(yīng)普通程序測(cè)定修飾程度和修飾部位酶修飾辦法第19頁(yè)第19頁(yè)第二節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回 第20頁(yè)第20頁(yè)第三節(jié) 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾 一、 概述二、 幾種主要修飾反應(yīng) 三、 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾第21頁(yè)第21頁(yè)一、 概述側(cè)鏈基團(tuán)修飾 采用一定辦法(普通為化學(xué)法)使酶分子側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子特

6、性和功效修飾辦法酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán) 構(gòu)成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上功效團(tuán)。有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等第22頁(yè)第22頁(yè)一、 概述作用研究各基團(tuán)作用及其對(duì)酶結(jié)構(gòu)、特性和功效影響(研究酶活性中心必需基團(tuán))改變酶分子性質(zhì)，提升實(shí)用價(jià)值測(cè)定某一基團(tuán)在酶分子中數(shù)量取得新酶種第23頁(yè)第23頁(yè)一、 概述類別蛋白類酶核酸類酶 側(cè)鏈基團(tuán)：磷酸基，核糖上羥基，嘌呤、嘧啶堿基上氨基和羥基(酮基)等第24頁(yè)第24頁(yè)二、 幾種主要修飾反應(yīng) ?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng) 烷基化反應(yīng) 氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng)第25頁(yè)第25頁(yè)酰化及其相關(guān)反應(yīng)第26頁(yè)第26頁(yè)烷基化反應(yīng) 第27頁(yè)第27頁(yè)氧化和還原反應(yīng) 第28頁(yè)第2

7、8頁(yè)芳香環(huán)取代反應(yīng) 定量測(cè)定第29頁(yè)第29頁(yè)三、 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾巰基氨基羧基咪唑基胍基二硫鍵第30頁(yè)第30頁(yè)1、 巰基化學(xué)修飾 巰基：許多酶活性中心催化基團(tuán)；形成二硫 鍵，穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)巰基含有很強(qiáng)親核性，采用巰基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶空間構(gòu)象、特性和功效。提升酶穩(wěn)定性慣用：?；⑼榛瘎?、馬來酰亞胺、二硫蘇 糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉第31頁(yè)第31頁(yè)第32頁(yè)第32頁(yè)2、 氨基化學(xué)修飾 氨基甲基化與乙酰化 賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺側(cè)鏈氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基-OH上 甲基轉(zhuǎn)移酶氨基烷基化 脫氨基作用或與氨基共價(jià)結(jié)合，屏蔽酶分

8、子側(cè)鏈上氨基 修飾劑：亞硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯第33頁(yè)第33頁(yè)第34頁(yè)第34頁(yè)3、羧基化學(xué)修飾 修飾劑與酶分子側(cè)鏈羧基進(jìn)行酯化、?；确磻?yīng)修飾劑：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異噁唑鹽等第35頁(yè)第35頁(yè)第36頁(yè)第36頁(yè)4、 咪唑基化學(xué)修飾 組氨酸。許多酶活性中心必需基團(tuán)修飾劑通過咪唑基氮原子烷基化或碳原子親核取代進(jìn)行修飾修飾劑：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37頁(yè)第37頁(yè)第38頁(yè)第38頁(yè)5、 胍基化學(xué)修飾 精氨酸。在結(jié)合帶有陰離子底物酶活性部位中起主要作用一些二羰基化合物在中性或弱堿性條件下與精氨酸胍基生成穩(wěn)定雜環(huán)

9、修飾劑：丁二酮、1,2-環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等第39頁(yè)第39頁(yè)第40頁(yè)第40頁(yè)6、 二硫鍵化學(xué)修飾 同巰基基團(tuán)類似還原辦法與巰基修飾辦法結(jié)合，制止再氧化成二硫鍵。可用于計(jì)算斷裂二硫鍵數(shù)目修飾劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、過甲酸等第41頁(yè)第41頁(yè)第42頁(yè)第42頁(yè)第三節(jié)結(jié)束?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng) 烷基化反應(yīng) 氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng)巰基化學(xué)修飾 氨基化學(xué)修飾 羧基化學(xué)修飾 咪唑基化學(xué)修飾 胍基化學(xué)修飾 二硫鍵化學(xué)修飾概述 幾種主要修飾反應(yīng) 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾第43頁(yè)第43頁(yè)第三節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回 第44頁(yè)第44頁(yè)第四節(jié) 大分子結(jié)合修飾一、 概念二、 大分子

10、結(jié)合修飾辦法三、 大分子結(jié)合修飾作用第45頁(yè)第45頁(yè)一、 概念利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一些精細(xì)改變，從而改變酶特性與功效辦法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡(jiǎn)稱為大分子結(jié)合法第46頁(yè)第46頁(yè)二、 大分子結(jié)合修飾辦法修飾劑選擇修飾劑活化修飾分離第47頁(yè)第47頁(yè)1、修飾劑選擇水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等PEG: 110KD。溶解度高，無抗原性，無毒 性，生物相容性好第48頁(yè)第48頁(yè)2、修飾劑活化需活化才干與酶分子側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)eg. 單甲氧基聚乙二醇(MPEG) (1) 聚乙二醇均三嗪衍生物 MPEG1, MP

11、EG2。對(duì)天冬酰胺酶等氨基進(jìn)行修飾 (2) 聚乙二醇琥珀酰亞胺衍生物 SS-MPEG, SSA-MPEG, SC-MPEG。pH7-10條件下對(duì)酶分子氨基進(jìn)行修飾 (3) 聚乙二醇馬來酸酐衍生物 PM。其中馬來酸酐通過酰胺鍵對(duì)酶分子上氨基進(jìn)行修飾 (4) 聚乙二醇胺類衍生物 對(duì)酶分子上羰基進(jìn)行修飾第49頁(yè)第49頁(yè)3、修飾將活化大分子修飾劑與經(jīng)分離純化酶液以一定百分比混合，在一定溫度、pH等條件下反應(yīng)。使修飾劑活化基團(tuán)與酶分子側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，進(jìn)行修飾第50頁(yè)第50頁(yè)4、分離經(jīng)過凝膠層析等方法，將含有不同修飾程度酶分子分開，從中取得含有很好修飾效果修飾酶第51頁(yè)第51頁(yè)三、大分子結(jié)合修飾作用提升

12、酶活力增強(qiáng)酶穩(wěn)定性減少或消除抗原性酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然SOD與修飾后SOD在人體血漿中半衰期第52頁(yè)第52頁(yè)第四節(jié)結(jié)束概念 大分子結(jié)合修飾辦法 大分子結(jié)合修飾作用修飾劑選擇修飾劑活化修飾分離提升酶活力增強(qiáng)酶穩(wěn)定性減少或消除抗原性第53頁(yè)第53頁(yè)第四節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回 第54頁(yè)第54頁(yè)第五節(jié) 金屬離子置換修飾及物理修飾一、 金屬離子置換修飾二、 物理修飾第55頁(yè)第55頁(yè)一、 金屬離子置換修飾1、 概念 把酶分子中金屬離子換成另一個(gè)金屬離子，

13、使酶特性和功效發(fā)生改變修飾辦法，稱為金屬離子置換修飾第56頁(yè)第56頁(yè)一、 金屬離子置換修飾2、 辦法 酶分離純化 除去原有金屬離子 加入置換離子加入金屬螯合劑(EDTA)，形成螯合物，透析、超濾、分子篩層析等除去普通都是二價(jià)金屬離子。比如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等只適合用于哪些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子酶第57頁(yè)第57頁(yè)一、 金屬離子置換修飾3、 作用 闡明金屬離子對(duì)酶催化作用影響提升酶活力增強(qiáng)酶穩(wěn)定性改變酶動(dòng)力學(xué)特性第58頁(yè)第58頁(yè)二、 物理修飾1、 概念 通過各種物理辦法使酶分子空間構(gòu)象發(fā)生一些改變，從而改變酶一些特性和功效辦法，稱為酶分子物理修飾第59

14、頁(yè)第59頁(yè)二、 物理修飾2、 作用 了解在不同物理?xiàng)l件下，因?yàn)槊阜肿涌臻g構(gòu)象改變而引發(fā)酶特性和功效改變情況探索極端環(huán)境中生物生存可能性及其潛力提升酶催化活性，增強(qiáng)酶穩(wěn)定性，改變酶催化動(dòng)力學(xué)特性第60頁(yè)第60頁(yè)二、 物理修飾3、 特點(diǎn) 不改變酶組成單位及其基團(tuán)，酶分子中共價(jià)鍵不發(fā)生改變。只是副鍵發(fā)生一些改變和重排可在一些變性劑作用下，首先破壞酶分子原有空間構(gòu)象，然后在不同物理?xiàng)l件下，使酶分子重新構(gòu)建新空間構(gòu)象第61頁(yè)第61頁(yè)第五節(jié)結(jié)束金屬離子置換修飾 物理修飾概念辦法作用概念作用特點(diǎn)第62頁(yè)第62頁(yè)第五節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回 第63頁(yè)第63頁(yè)第六節(jié) 酶化學(xué)修飾應(yīng)用 一、 在酶學(xué)研究方面應(yīng)用二、 在醫(yī)藥方

15、面應(yīng)用三、 在工業(yè)方面應(yīng)用四、 在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中應(yīng)用 化學(xué)修飾辦法不足第64頁(yè)第64頁(yè)一、 在酶學(xué)研究方面應(yīng)用 酶活性中心研究 酶空間結(jié)構(gòu)研究 采用含有熒光特性修飾劑，可借助熒光光譜研究，分析各基團(tuán)在酶分子中空間分布情況 采用巰基修飾劑，可理解酶分子中半胱氨酸數(shù)目及分布情況，擬定肽鏈數(shù)目和二硫鍵數(shù)目 酶作用機(jī)制研究 理解各種殘基及側(cè)鏈基團(tuán)在酶催化過程中作用 慣用修飾辦法有親和標(biāo)識(shí)法、差別標(biāo)識(shí)法、氨基酸(核酸)置換法等第65頁(yè)第65頁(yè)二、 在醫(yī)藥方面應(yīng)用 減少或者消除酶抗原性 增強(qiáng)醫(yī)藥用酶穩(wěn)定性(半衰期延長(zhǎng)) 改變組織分布 酶經(jīng)化學(xué)修飾后，能在血液中被靶器官選擇性地吸取第66頁(yè)第66頁(yè)三、 在工業(yè)方面應(yīng)用 提升工業(yè)用酶活力 增強(qiáng)工業(yè)用酶穩(wěn)定性 改變酶動(dòng)力學(xué)特性第67頁(yè)第67頁(yè)四、 在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中應(yīng)用經(jīng)側(cè)鏈基團(tuán)修飾，酶分子能溶解于有機(jī)溶劑，均勻分布于溶劑中，提升酶催化效率和穩(wěn)定性eg. 用MPEG對(duì)脂肪酶、過氧化氫酶、