苜蓿遺傳轉化的研究現(xiàn)狀與發(fā)展

1、苜蓿遺傳轉化的研究現(xiàn)狀與發(fā)展目 錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc509099466 引言 PAGEREF _Toc509099466 h 3 HYPERLINK l _Toc509099467 1. 苜蓿轉基因技術研究現(xiàn)狀 PAGEREF _Toc509099467 h 3 HYPERLINK l _Toc509099468 1.1 農(nóng)桿菌介導法 PAGEREF _Toc509099468 h 3 HYPERLINK l _Toc509099469 1.2 基因槍法 PAGEREF _Toc509099469 h 4 HYPERLINK l _Toc5090

2、99470 1.3 花粉管通道法 PAGEREF _Toc509099470 h 4 HYPERLINK l _Toc509099471 1.4 電擊法 PAGEREF _Toc509099471 h 5 HYPERLINK l _Toc509099472 1.5 PEG介導法 PAGEREF _Toc509099472 h 5 HYPERLINK l _Toc509099473 2. 苜蓿遺傳轉化研究進展 PAGEREF _Toc509099473 h 6 HYPERLINK l _Toc509099474 2.1 苜蓿遺傳轉化的研究現(xiàn)狀 PAGEREF _Toc509099474 h 6

3、HYPERLINK l _Toc509099475 2.2 苜蓿遺傳轉化的應用 PAGEREF _Toc509099475 h 6 HYPERLINK l _Toc509099476 2.2.1 苜蓿遺傳轉化在提高非生物脅迫的應用 PAGEREF _Toc509099476 h 6 HYPERLINK l _Toc509099477 2.2.2 苜蓿遺傳轉化在提高生物脅迫的應用 PAGEREF _Toc509099477 h 7 HYPERLINK l _Toc509099478 2.2.3 苜蓿遺傳轉化在品質改良方面的應用 PAGEREF _Toc509099478 h 9 HYPERLIN

4、K l _Toc509099479 3. 苜蓿遺傳轉化研究趨勢 PAGEREF _Toc509099479 h 9 HYPERLINK l _Toc509099480 4. 結語 PAGEREF _Toc509099480 h 10 HYPERLINK l _Toc509099481 參考文獻 PAGEREF _Toc509099481 h 10引言紫花苜蓿是世界上分布最廣的多年生豆科植物之一。在中國，它也是一個最重要的豆科牧草。它不僅產(chǎn)量高，而且營養(yǎng)豐富。但是，隨著草地鹽漬化程度的加劇、草地生態(tài)環(huán)境的破壞和草地植被的嚴重退化，應培育大量的新品種，以滿足草地畜牧業(yè)對牧草生產(chǎn)的需求。傳統(tǒng)的選育抗

5、鹽、抗旱、抗病昆蟲的育種方法具有長期、緩慢的不利因素。利用轉基因技術培育苜?？剐孕缕贩N是牧草育種中最有效的方法。1986年，農(nóng)桿菌促成的首例苜蓿轉化成功。近10年來，苜蓿轉基因研究取得了很大進展，本文綜述了近十年來苜蓿轉基因研究。1. 苜蓿轉基因技術研究現(xiàn)狀1.1 農(nóng)桿菌介導法農(nóng)桿菌是一種土壤中的革蘭氏陰性桿菌，主要分為發(fā)根農(nóng)桿菌和分根癌農(nóng)桿菌兩類，它們可以通過傷口和傷口浸染植物冠癭和毛根。農(nóng)桿菌介導法是植物轉基因工程發(fā)展最為明顯、最成熟、應用最廣泛的方法。它吸收自然轉化機制的優(yōu)點，消除了大量的T-DNA區(qū)基因，使其失去其致瘤性，并可以在感染植物的傷口把T-DNA轉移到受體植物的基因組。早在1

6、986年初，Deak 等以苜蓿莖段為外植體，通過農(nóng)桿菌介導的方法導入紫花苜蓿，并獲得轉基因植株。1985年，horsh等以葉片為外植體，和農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法成立，擴大了農(nóng)桿菌侵染受體使用。1988年，Chabaud等用農(nóng)桿菌介導葉和苜蓿葉柄感染表明，農(nóng)桿菌種類及共培養(yǎng)時間均影響苜蓿遺傳轉化的重要因素。Hill等用農(nóng)桿菌介導的轉化編碼苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白基因轉入不同品種的苜蓿，并對再生植株噴涂AMV病毒，發(fā)現(xiàn)轉基因苜蓿比野生型苜?？笰MV強。1992年，Wandelt 等介紹了豌豆蛋白基因導入苜蓿根癌農(nóng)桿菌介導法。轉基因苜蓿的球蛋白含量提高到0.1%，是普通苜蓿的20倍。Tabe等用根癌農(nóng)桿

7、菌介導的葵花籽蛋白基因轉入苜蓿的引入，使轉基因苜蓿蛋白含量占葉片可溶性蛋白的0.1%。近年來，國內已經(jīng)在農(nóng)桿菌介導苜蓿轉化方面獲得巨大的進步。2002年，黃劍成功地建立了苜蓿高頻再生體系。在農(nóng)桿菌介導法的基礎上，將甜菜堿醛脫氫酶基因導入苜蓿，獲得轉基因耐鹽苜蓿。金樹梅與苜蓿子葉為外植體，農(nóng)桿菌介導的轉化Gus基因轉入某一種苜蓿中。曹致中等利用農(nóng)桿菌介導法，建立了“中苜一號”紫花苜蓿的遺傳轉化體系，進一步優(yōu)化了基因的反應條件。梁慧敏等用農(nóng)桿菌介導BADH基因導入苜蓿。經(jīng)格斯組織化學染色和pcr檢測，獲得了26株抗性再生苜蓿。呂德洋利用農(nóng)桿菌介導的方法，將富含氨基酸的蛋白質基因導入紫花苜蓿，轉基因

8、植株中氨基酸含量的測定明顯高于野生型植株。與其他轉基因方法相比，農(nóng)桿菌介導法不僅易于操作，而且大多數(shù)基因在單位點被整合到植物基因組中，有利于基因表達。因此，它是植物轉基因研究中最常用的方法。不同基因型苜蓿對農(nóng)桿菌的敏感性不同，導致遺傳轉化的重復性較差。由于不同的再生和轉化位點，“嵌合體”的問題還有待于進一步研究和解決。1.2 基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，首先由桑福德提出并建立了一個高效的基因轉化方法，其原理是將外源基因包裹在一個直徑約1 2毫米鎢或金顆粒表面，通過加快植物外植體的轟擊，穿透植物細胞壁和細胞膜和外源基因進入植物體內的細胞。該方法操作簡單，轉換效率高，受主材料來源廣。1995年

9、，Pereira和其他將軍轟擊方法載體的NPT基因在不同的7個苜蓿品種，并發(fā)現(xiàn)基因已整合到苜?；蚪M，發(fā)現(xiàn)基因型不影響苜?；蛐?。拉邁亞和其他格斯基因成功導入苜?；ǚ劢Y構通過基因槍的方法和在轉基因植物中的表達。在f1代基因序列分析中，F(xiàn)1代幼苗中有30%具有格斯基因。在中國，王瑩等對“中苜一號”苜蓿愈傷組織為靶細胞的基因槍將lea3基因在紫花苜蓿，經(jīng)篩選獲得了草銨膦抗性愈傷組織，導致抗性植株，發(fā)現(xiàn)轉基因植株具有較強的耐鹽性。與農(nóng)桿菌介導轉化相比，基因槍轉化的頻率仍然較低，所引入的基因序列和數(shù)量特性不強，可能導致植物基因表達異常。然而，一般來說，基因打靶的方法仍然是一種很有前途的基因轉化方法。1

10、.3 花粉管通道法花粉管通道法首先是由周光裕提出的。這種方法為植物生物的基因轉化開辟了一條新的途徑。其原理是在授粉過程中向子房注射含有目標基因的溶液。在受精過程中，植物將外源基因導入受精卵，并進一步整合到受體細胞基因組中。隨著受精卵的發(fā)育，將獲得一個具有靶基因的個體。該技術避免了復雜繁重的工作，操作簡單。1988年，羅等人首先介紹了目標基因轉入水稻用花粉管通道和Southern雜交和酶活性測定表明，外源基因已整合到水稻基因組并表達。在中國，牛一丁報告質粒載體含基因阿爾岡金苜蓿體內通過花粉管通道法引入PCR和southemblot檢測表明，外源基因已整合到苜蓿基因組。張立全等將鹽生植物紅樹的總D

11、NA通過花粉管通道導入紫花苜蓿，并成功獲得的轉基因植物。pcr檢測表明外源DNA已在轉基因植株中表達?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ娜秉c是導入外源基因片段的轉化植株可能有少量的沒有目的性狀的基因片段，只能用于開花植物，只有開花期才能轉化。目前，外源基因整合的機制還不清楚，轉換頻率低，重復性不高。相信隨著研究的深入，花粉管通道技術和相關理論將更加完善，可以更廣泛地應用于植物轉化的研究。1.4 電擊法電擊也叫擊穿孔法，是高速電脈沖在植物細胞壁上開孔使用，基因可以通過微孔進入細胞，并整合到受體植物的基因組，但細胞本身的生理活性不受影響，且操作簡單，轉化率高效率，特別適合于研究瞬時表達。在國際植物分子生物學會議上，李

12、寶劍報告了電擊法的應用結果。此后，電休克法已成功地應用于煙草、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、水稻等作物的遺傳改良試驗。1992年，Deineke等采用電擊將基因轉化人干擾素基因轉入苜蓿體，38代轉基因植株獲得成功。在國內，黃少星等方法通過電擊直接將格斯基因導入苜蓿原生質體中，檢測到外源基因被完全表達，獲得了轉基因植株。1.5 PEG介導法PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）介導的轉化是化學轉化的方法，由Davey和Krens創(chuàng)立的，這種方法的原理是通過復方聚乙二醇聚鳥氨酸L-鈣磷在堿性條件下能促進細胞膜的內吞作用時，原生質體誘導外源基因的攝入基因與植物基因組整合的目的。基因轉

13、化的方法是反復強勢，并從細胞團原生質體的形成是容易選擇，嵌合體少，但植物原生質體再生系統(tǒng)多數(shù)是難以建立，即使建立再生體系植物原生質體仍然存在基因型效應、原生質體培養(yǎng)、長周期運行繁瑣，嚴重限制了該方法的應用。2. 苜蓿遺傳轉化研究進展2.1 苜蓿遺傳轉化的研究現(xiàn)狀 目前，利用分子生物學育種技術提高紫花苜蓿的品種特性是世界苜蓿研究的主要方向。研究內容包括：基因克隆、表達載體、啟動子和標記選擇、轉基因植物的高表達特性和田間釋放安全性問題，轉基因苜蓿帶來了知識產(chǎn)權和產(chǎn)業(yè)挑戰(zhàn)。同時，巨大的進步和突破已經(jīng)在苜蓿轉基因育種，如苜蓿抗膨脹病、抗除草劑、抗病蟲以及延緩植物木質化過程來提高苜蓿質量。在發(fā)達國家，轉

14、基因技術已廣泛應用于苜蓿、苜蓿等多個領域，在抗病育種、減少病害、提高干物質消化率、生物降解材料開發(fā)、生物土壤、生物活性和疫苗制劑等方面取得了進展和突破。在國外的轉基因苜蓿的主要研究方向：利用基因工程技術對苜蓿冷抗寒基因表達的廣泛研究；轉基因紫花苜蓿植物紫花苜蓿抗寒性的調節(jié)；技術提高抗洪水的能力；休眠；開展基因的表達及轉基因苜蓿研究調節(jié)等。利用低溫誘導特異蛋白調控抗旱特性、相關基因的克隆和基因轉化等方面的研究取得了一定進展。在低溫誘導苜蓿已在具體的防凍蛋白合成的觀察，苜蓿和其他材料已被分離和鑒定的低溫誘導基因表達調控的低溫誘導抗旱、抗寒性的表達是一種新型的電流抗性育種理念。隨著生物技術的發(fā)展，國

15、內外許多國家獲得了許多轉基因植物，在改善生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮了重要作用。總之，國內外報道的轉基因基因包括抗病性、抗蟲性、抗除草劑性、品質改良、固氮和抗逆性。目標基因的導入主要是通過遺傳轉化實現(xiàn)的。外源基因可直接導入DNA，農(nóng)桿菌介導的轉化和花粉管通道法。 2.2 苜蓿遺傳轉化的應用 苜蓿在其他國家的畜牧生產(chǎn)中占有十分重要的地位。與其他牧草相比，紫花苜蓿轉基因研究早、范圍廣、成功案例多。苜蓿遺傳轉化的內容也非常廣泛，包括品質改良、除草劑抗性、抗病性、抗病性等。2.2.1 苜蓿遺傳轉化在提高非生物脅迫的應用在抗寒突變體的篩選通過紅色報告，苜蓿葉片愈傷組織誘導的（在1個月左右，誘導傳代不超過3代）突變試

16、驗材料，用EMS誘變篩選，成功獲得抗寒性突變體。此外，許多研究表明生物和非生物脅迫都與活性氧有關。超氧化物歧化酶（SOD）能消除活性氧對細胞膜的損傷。Mckersie 等用煙草錳超氧化物歧化酶C DNA導入紫花苜蓿，轉基因苜?？购缘奶岣吆透呱婺芰Ρ３?。在抗旱方面：張志勝和趙世緒以PEG作為誘導劑的篩選劑，通過3種途徑獲得抗旱性和穩(wěn)定性方面，抗 20%PEG 和抗 25%PEG 的愈傷組織以及抗 20%PEG 的帶芽愈傷組織，并從抗 20%PEG 的愈傷組織和帶芽愈傷組織獲得了再生植株。土壤鹽漬化是影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的一個嚴重問題。在中國有大面積的鹽堿地，且每一年的趨勢逐年遞增。地球上的淡水資源

17、僅占地球水面面積1.6%。在人口增加、耕地減少、淡水資源短缺的嚴峻壓力下，如何充分利用大面積鹽堿地是亟待解決的問題。傳統(tǒng)育種方法選育耐鹽品種進展緩慢。隨著分子生物學的發(fā)展，人們可以利用基因工程技術提高牧草的耐鹽性。在耐鹽篩選方面，Croughan等選擇的紫花苜蓿耐鹽細胞系可忍耐 1%Na Cl。中國農(nóng)科院北京畜牧所也篩選除了在抗鹽量為 0.3%的土壤中生長良好的苜蓿再生植株。在鋁耐性選擇中，紫花苜蓿對鋁毒害敏感，易導致根系發(fā)育受阻，產(chǎn)量低。2004年，羅曉英對苜蓿在蘋果酸脫氫酶基因的表達，通過抗生素篩選、組織化學染色和PCR擴增技術鑒定轉基因植物和轉基因植物耐鋁脅迫試驗，轉基因和非轉基因株根相

18、對伸長率的比較分析，對轉基因株系的根伸長量相對較3.6% 22.5%，表明在MDH基因在轉基因苜蓿表達能提高耐鋁毒。 2.2.2 苜蓿遺傳轉化在提高生物脅迫的應用植物抗毒素是一種低分子量的抗菌化合物的植物攻擊外部病原體合成了抵抗病原菌活性。它是植物的第二大代謝產(chǎn)物，與紫花苜蓿廣譜抗真菌能力有關。這充分表達了植物抗毒素基因苜?？梢缘挚挂恍┎≡约毦嶒灲Y果表明，從花生植物抗毒素轉基因而成的轉基因苜蓿對苜蓿假盤菌(可引起褐斑病)的抵抗力明顯增強。同樣，充分表達異黃酮-O-轉甲基酶(IOMT)的轉基因苜蓿對苜蓿假盤菌的抵抗力也有明顯增強。幾丁質和1,3-葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分。幾丁質酶和1,

19、3-葡聚糖酶催化二者的水解，從而抑制真菌生長。結果表明，充分表達-1,3-葡聚糖酶紫花苜?？梢詼p少大雄疫主要感染的嚴重性（引起根腐?。Ｄ壳耙寻l(fā)現(xiàn)并廣泛應用的兩種抗蟲基因：一種是蘇云金芽孢桿菌的內毒素基因，另一種是bt毒素蛋白基因，另一種是高等植物蛋白酶抑制劑基因或pi基因。1996 年 Sneh 等人利用 TDL-PCR 的方法，參照雙子葉植物的偏愛密碼子，對Gen Bank 中的 Cry IC 基因(1890bp)進行了人工改造，替換了 286 個堿基，12 個 ATTTA序列被改進，在基因下游增加了 TAG 終止密碼子，G+C 含量由原來的 36.6%增加到44.8%，顯著提高了轉基因苜

20、蓿的抗蟲性，轉基因苜蓿具有較高的抗灰翅和甜菜葉蛾的特性，創(chuàng)造了基因改造成功的先例。Mc Caslin苜蓿轉Bt基因實驗結果表明，苜蓿象鼻蟲和三葉蟲可以被控制。托馬斯發(fā)現(xiàn)，轉基因苜蓿從煙草天蛾抗彈性蛋白酶抑制劑能減少薊馬喂養(yǎng)損害中的表達。Javie等人將番茄蛋白酶抑制劑基因轉化紫花苜蓿，轉基因植株對菜蛾有較好的抗性。番茄蛋白酶抑制劑有兩種：一是番茄蛋白酶抑制劑，對8.1kd分子量，只有一個活動中心，主要抑制糜蛋白酶；另一個是番茄蛋白酶抑制劑，對12.3kd成熟肽分子量，有兩個活性中心，也可以抑制蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。國內的盧光也對紫花苜?？寡粱騁NA的初步研究，他將雪花蓮凝集素基因GNA插入雙

21、元載體P bi121格斯基因的上游，得到植物表達載體p lg66m。GNA基因和格斯基因構成融合基因，共享一個CA mv35s啟動子。將表達載體導入農(nóng)桿菌LBA4404，和LBA4404 / P lg66m得到應變。LBA4404/pBI P株lg66m浸泡苜蓿種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，組織學檢查GNA紫花苜蓿體內容短期積累過程中表現(xiàn)出格斯在幼苗的表達，苜蓿苗期對蚜蟲抗性的影響，但幼苗生長第三葉，格斯基因的表達在苜蓿葉表達效率不高，但仍然可以在根檢測基因表達，這可能是由于外源DNA不插入植物分生組織細胞的染色體，但游離在細胞核；或在植物細胞分裂過程中，基因的插入和遺傳穩(wěn)定性丟失。隨著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模

22、集約化發(fā)展，化學除草劑得到了廣泛應用。但是，由于化學除草劑使用時間長、耗時長，對牧草、人畜等有害。人們希望通過基因工程將抗除草劑基因導入牧草中來解決上述問題。目前，bar基因被廣泛用作抗除草劑基因。Denk等利用轉基因苜蓿根瘤菌雙載體轉染新霉素，得到廣譜除草劑Basta和herbiance植物能在田間1.2kg/hm2抵抗除草劑。黃少星提出了一個新的電穿孔格斯基因型直接進入苜蓿根原生質體和訓練計劃中的轉基因植物原生質體再生的方法，提高苜蓿的質量，為有用的外源基因，包括抗病、抗蟲、抗除草劑，提供了一個有效的實驗系統(tǒng)。黎茵等用苜蓿體細胞胚作為農(nóng)桿菌介導的轉化受體。通過對格斯基因瞬時表達率的分析，研究了轉化體系的最佳實驗參數(shù)。實驗結果表明，負壓處理 10min 和共培養(yǎng) 5d 時,表達率最高(可達 17.4%)。 2.2.3 苜蓿遺傳轉化在品質改良方面的應用品質改良主要涉及蛋白質含量、氨基酸組成、淀粉等多糖類化合物以及脂類化合物的組成。高直鏈淀粉轉基因油菜和直鏈淀粉含量下降的轉基因油菜和40%月桂酸轉基因煙草相繼成功。其中一些已進入田間試驗。此外，轉基因技術提高稻米品質，解決人類營養(yǎng)不良已成為可能。將玉米醇溶蛋白基因導入馬鈴薯后，轉基因植株塊莖中必需氨基酸含量增加了1