低氮源培養(yǎng)對鼠李糖乳桿菌脅迫耐受能力的影響

1、PAGE PAGE - 10 -低氮源培養(yǎng)對鼠李糖乳桿菌脅迫耐受能力的影響益生菌具有維持腸道菌群穩(wěn)定、調(diào)節(jié)免疫、產(chǎn)生有益物質(zhì)、抑制病原微生物等益生作用1。其中乳酸菌及其發(fā)酵乳制品已成為目前最受歡迎的功能食品2，近年來在國內(nèi)亦受到越來越多的關(guān)注?；钚允侨樗峋谑称分羞M行發(fā)酵和在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要基礎(chǔ)。研究人員認為食品中益生菌的活菌數(shù)達到106107CFU/g，日攝入量達到109CFU方能發(fā)揮較好的益生功能3。然而，乳酸菌在生產(chǎn)、貯藏、運輸和消費過程中，會遭受來自于工藝流程、宿主、及自身代謝所產(chǎn)生的多種脅迫，產(chǎn)生嚴重的活性損失4。因此，如何提高乳酸菌的脅迫耐受能力是重要的研究課題。鼠李糖乳桿

2、菌(Lactobacillusrhamnosus)hsryfm1301分離自中國巴馬的長壽老人，具有顯著功能特性5。該菌株對熱脅迫和氧化脅迫存在明顯的交叉適應(yīng)6。將鼠李糖乳桿菌hsryfm1301分別在熱脅迫或氧化脅迫條件下進行轉(zhuǎn)錄組-表型匹配，發(fā)現(xiàn)多達32個寡肽轉(zhuǎn)運、肽酶和氨基酸代謝等氮代謝相關(guān)基因受到下調(diào)；進一步研究顯示，低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力7。降低培養(yǎng)環(huán)境中的氮源濃度有助于鼠李糖乳桿菌耐受生產(chǎn)過程(如噴霧干燥)中的熱脅迫和氧化脅迫。另一方面，氨基酸在乳酸菌的酸脅迫、膽鹽脅迫和滲透壓脅迫等的耐受中發(fā)揮積極作用4,8。因此，氮源濃度的降低是否會影響

3、菌株對其他脅迫的耐受尚未可知。氮源作為所有培養(yǎng)基都不可或缺的成分，其含量對脅迫耐受的影響不容忽視。本文主要探究鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在低氮源環(huán)境下的脅迫耐受變化，以期提高菌株在生產(chǎn)中的脅迫耐受能力。1材料與方法1.1菌株鼠李糖乳桿菌hsryfm1301于2022年分離自廣西省巴馬瑤族自治縣的長壽老人，具有顯著的降血脂功能5，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCCNo.8545)。1.2材料與試劑胃蛋白酶(110000)、牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；2TaqPCRMasterMix，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉浸粉8.0、酵母浸粉4.0、

4、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸氫二銨2.0、乙酸鈉5.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.04、吐溫801.0，pH(6.50.2)。不同氮源濃度的MRS培養(yǎng)基通過添加不同量的胰蛋白胨進行調(diào)整(表1)7。表1不同氮源濃度培養(yǎng)基中胰蛋白胨的濃度Table1ConcentrationsoftryptonepeptoneinthemodifiedMRSmedia人工胃液：氯化鈉5.0g/L、胃蛋白酶3.0g/L，用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.5。膽鹽培養(yǎng)基：準確稱取一定量的膽鹽溶于MRS液體培養(yǎng)基中，使其膽鹽質(zhì)量濃度為1g/L，用0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH(6.50.2)，高壓滅菌后(1

5、21，15min)，冷卻備用。1.3儀器與設(shè)備Biophotometerplus核酸蛋白測定儀、5424R臺式冷凍離心機，艾本德中國有限公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150BSH生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DNA水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司；藍光透射儀，天根生化科技(北京)有限公司。1.4實驗方法1.4.1菌株的培養(yǎng)與鑒定從凍存管中取鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的凍干菌粉(約1.0g)，置于10mLMRS液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)24h；將菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化；挑取單菌落，在MR

6、S液體培養(yǎng)基37培養(yǎng)24h；4保藏備用。將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%(體積分數(shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)12h。然后4，6000g離心10min收集菌體。利用細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取菌株的DNA，使用鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的菌株鑒定引物進行擴增，并與母株擴增圖譜進行比較9。1.4.2生長能力比較將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到含不同氮源濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，放置37培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔1h測1次OD600值，記錄不同培養(yǎng)基菌體OD600值到達0.5、1.0、2.

7、0、3.0和4.0時的時間，每次測定平行3次。1.4.3活菌數(shù)測定將處理樣品10倍梯度稀釋于MRS液體培養(yǎng)基，滴注5L稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)2448h；選擇菌落數(shù)在30200(稀釋梯度為Tdilution)的菌斑計數(shù)為Ncolony。CFU計算方法：CFU/mL=10Tdilution200Ncolony10。1.4.4熱脅迫存活率測定將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0PMRS和MRS培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5。然后3支直接進行熱脅迫(54，1h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46，1h)預(yù)處理，再進行熱脅迫(54，1h)處理；

8、3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5mmol/LH2O2，1h)預(yù)處理，再進行熱脅迫(54，1h)處理；分別測定處理前后的活菌數(shù)6。1.4.5氧化脅迫存活率測定將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0PMRS和MRS培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5。然后3支直接進行氧化脅迫(2.0mmol/LH2O2，1h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46，1h)預(yù)處理，再進行氧化脅迫(2.0mmol/LH2O2，1h)；3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5mmol/LH2O2，1h)預(yù)處理，再進行氧化脅迫(2.0mmol/LH2O2，1h)；分別測定處理前后的活菌數(shù)6。1.4.6

9、不同生長階段耐熱和耐氧化脅迫能力的測定將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到0PMRS和MRS培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5、1.0、2.0、3.0、4.0，然后每個階段分別進行熱脅迫(54，1h)和氧化脅迫(1.6mmol/LH2O2，1h)處理，并測定每個階段經(jīng)熱脅迫和氧化脅迫后的活菌數(shù)。1.4.7菌株對模擬胃腸道環(huán)境耐受能力的測定將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0mL的菌懸液接種至9.0mL的pH

10、2.5人工胃液，37培養(yǎng)3h，分別在0和3h利用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0mL的菌懸液接種至9.0mL的0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)3h，分別在0和3h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。1.4.8菌株對高滲透壓和低溫脅迫的耐受能力的測定將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至OD600值達到2.0左

11、右，離心收集菌體，用添加80g/LNaCl的MRS培養(yǎng)基重懸，37培養(yǎng)4h，分別在0和4h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，取1mL菌液凍存于-20，分別在0和24h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。1.4.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理采用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在低氮源條件下的生長能力使用鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的菌株鑒定引物對活化菌株的DNA進行擴增，獲得的

12、擴增圖譜與母株擴增圖譜一致(圖1-A、圖1-B)10，表明純化獲得的菌株即為鼠李糖乳桿菌hsryfm1301，實驗數(shù)據(jù)可與前期數(shù)據(jù)進行對比。低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力7，但是氮源濃度同時會影響鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的生長能力。菌株在4種培養(yǎng)基中，OD600值均能在4h達到1.0；在OD600值達到2.0之前，氮源濃度對鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的生長速度影響不大。隨著菌體的繼續(xù)生長，氮源開始成為限制因素，鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的OD600值在0PMRS中達到3.0和4.0的時間均顯著晚于MRS培養(yǎng)基(超過1h)(圖1-C)。值得注

13、意的是，鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的OD600值在0PMRS中最先到達0.5，在2PMRS中最遲到達2.0，表明高濃度氮源能夠抑制菌株生長。在實際生產(chǎn)中應(yīng)隨生長時期調(diào)整氮源濃度，以促進菌株的生長。A-特異性引物對實驗菌株的擴增圖譜(H1H4為鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的特異性擴增引物對)；B-特異性引物對鼠李糖乳桿菌hsryfm1301母株的擴增圖譜；C-鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中生長至特定濃度的時間圖1鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1GrowthofL.rhamnosushsryfm1301inmediacon

14、tainingdifferentconcentrationsoftryptonepeptone注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)(下同)2.2鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在低氮源培養(yǎng)下的熱脅迫-氧化脅迫交叉適應(yīng)鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在MRS中對熱脅迫和氧化脅迫存在顯著的交叉適應(yīng)6。同種脅迫預(yù)處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力提高至將近90%以上；氧化預(yù)處理能夠?qū)⒕甑臒崦{迫存活率從1%提高至46%(圖2-A)，而熱預(yù)處理能夠?qū)⒕甑难趸{迫存活率從2%提高至20%(圖2-B)。這一特性有助于菌株耐受噴霧干燥等生產(chǎn)過程中的脅迫環(huán)境。在0PMRS中，鼠李糖乳桿菌hsryfm13

15、01對熱脅迫和氧化脅迫的適應(yīng)能力大幅提升，分別達到39%和35%；同種脅迫預(yù)處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力進一步提升至80%以上(圖2-C圖2-D)。而且氧化預(yù)處理使熱脅迫的耐受能力提高至96%(圖2-C)，熱預(yù)處理使氧化脅迫的耐受能力提高至69%(圖2-D)。因此，熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)仍然存在，雖然由于基礎(chǔ)耐受能力的上升導(dǎo)致了脅迫耐受提升倍數(shù)的下降，但是交叉適應(yīng)獲得的脅迫耐受絕對值進一步提升。表明，氮源降低是實現(xiàn)熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)的重要原因，但不是唯一原因；在實際生產(chǎn)中可以通過脅迫預(yù)處理和氮源調(diào)整進一步提高鼠李糖乳桿菌的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。A-MRS中熱預(yù)處理(46，1h)和氧化預(yù)處理

16、(0.5mmol/LH2O2，1h)對菌株熱脅迫(54，1h)耐受能力的影響；B-MRS中熱預(yù)處理(46，1h)和氧化預(yù)處理(0.5mmol/LH2O2，1h)對菌株氧化脅迫(2.0mmol/LH2O2，1h)耐受能力的影響；C-0PMRS中熱預(yù)處理(46，1h)和氧化預(yù)處理(0.5mmol/LH2O2，1h)對菌株熱脅迫(54，1h)耐受能力的影響；D-0PMRS中熱預(yù)處理(46，1h)和氧化預(yù)處理(0.5mmol/LH2O2，1h)對菌株氧化脅迫(2.0mmol/LH2O2，1h)耐受能力的影響圖2鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在MRS和0PMRS中的熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)Fig.2The

17、heat-oxidativestresscrossadaptationofL.rhamnosushsryfm1301inMRSand0PMRS2.3低氮源環(huán)境下生長時期對菌株熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的影響前期研究在OD600=0.5的條件下發(fā)現(xiàn)了鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)現(xiàn)象，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了降低氮源對熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的提升作用6-7，但是低氮源在其他生長時期的影響作用尚不清晰。將鼠李糖乳桿菌hsryfm1301分別在MRS和0PMRS中培養(yǎng)至OD600值達到0.5、1.0、2.0、3.0和4.0，并檢測菌體的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。如圖3所示，鼠

18、李糖乳桿菌hsryfm1301在不同生長階段表現(xiàn)出不同的耐熱能力。當菌株生長至OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，0PMRS菌體的熱脅迫存活率均高于正常MRS組。尤其當OD600值達到2.0時，0PMRS組的存活率為73.7%，而MRS為0.57%，低氮源培養(yǎng)(0PMRS)后的存活率提高了129倍(圖3-A)。這表明在菌株的生長前期低氮源濃度培養(yǎng)有利于提高其耐熱能力。當OD600值達到4.0時，對照組的存活率與0PMRS組無顯著性差異。A-熱脅迫(54，1h)；B-氧化脅迫(1.6mmol/LH2O2，1h)圖3氮源對不同生長時期鼠李糖乳桿菌hsryfm1301熱脅迫和氧化脅迫耐受

19、能力的影響Fig.3ThermotoleranceandaerotoleranceofL.rhamnosushsryfm1301duringdifferentgrowthstagesinMRSand0PMRS同樣鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在不同的氮源濃度下各生長階段的氧化脅迫存活率所呈現(xiàn)出的規(guī)律和熱脅迫相似。在OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，正常MRS培養(yǎng)后菌株的存活率顯著低于0PMRS。其中當OD600值為2.0時這種現(xiàn)象最為明顯，在這個生長時期低氮源培養(yǎng)(0PMRS)的存活率比正常MRS組提高了40倍(圖3-B)；而在OD600值為4.0時，低氮源組和正常組無顯著差異

20、。這說明高濃度胰蛋白胨培養(yǎng)不利于菌株抗氧化。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中較為重要的指數(shù)期和穩(wěn)定前期，低氮源濃度環(huán)境下的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301有更強的耐熱和耐氧化能力；而且菌株在低氮源環(huán)境中生長至OD600值為2.0時，其耐熱能力和耐氧化能力最佳。2.4鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在低氮源培養(yǎng)下的常見脅迫耐受能力在指數(shù)期，低氮源濃度環(huán)境對鼠李糖乳桿菌hsryfm1301的耐熱和耐氧化強化效果最佳。但是已有文獻表明，氮源對乳酸菌的脅迫耐受往往發(fā)揮積極作用。在高滲環(huán)境下，嗜酸乳桿菌會在胞內(nèi)累積脯氨酸11；半胱氨酸作為氧化還原酶的核心位點，有助于發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌抵御氧化脅迫12-13。此外，唾液乳桿菌會利