高效液相色譜柱基礎(chǔ)知識PPT

1、關(guān)于高效液相色譜柱基礎(chǔ)知識第一張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、填料壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.220m(510m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。第二張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月按用途分類分析型常規(guī)分析柱，內(nèi)徑25mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長1030cm,粒徑3.5或5m，；窄徑

2、柱（又稱半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑12mm，柱長1020cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.20.5mm；制備型半制備柱，內(nèi)徑5mm；實驗室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱，內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。色譜柱的種類第三張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月按分離機(jī)制分類吸附型色譜柱化學(xué)鍵合相色譜柱(分配型）正相鍵合相色譜柱反相鍵合相色譜柱離子交換色譜柱凝膠色譜柱親合色譜柱手性色譜柱色譜柱的種類第四張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月色譜柱的種類按填料基質(zhì)分類硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。具有高強(qiáng)度，不會在溶劑中收縮或膨脹。能提

3、供一個含有游離硅羥基的表面，可以通過硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成正相、反相、離子交換、分子排阻色譜用填料。適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩(wěn)定，易溶解。 第五張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月高分子聚合物常用的是以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的球形填料。壓力限度比無機(jī)填料低；在整個pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來清洗色譜柱 ；聚合物基質(zhì)在流動相發(fā)生變化時會出現(xiàn)膨脹或收縮，對于小分子化合物柱效低；主要用于大分子化合物，常制成凝膠柱或離子交換柱。 色譜柱的種類第六張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)鍵合相色譜柱定義：將有機(jī)官能

4、團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。 種類非極性鍵合相（反相）：鍵合相表面基團(tuán)為非極性羥基，如C18、C8、C3、乙基、甲基與苯基。中等極性鍵合相：常見的為醚基和二羥基鍵合相，既可做正相又可做反相色譜的固定相，視流動相極性而定。極性鍵合相（正相）：常用的為氨基、氰基、二醇基鍵合相。第七張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)鍵合相色譜柱的合成第八張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)鍵合相一般采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷烴氯硅烷與硅膠表面的游離硅羥基反應(yīng)，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。由于空間位阻效應(yīng)和其它因素

5、的影響，使得大約有4050%的硅醇基未反應(yīng)。殘留硅羥基可以減小非極性鍵合相表面的疏水性，對極性溶質(zhì)（特別是堿性化合物）產(chǎn)生次級化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化，使堿性組分的峰形拖尾。 化學(xué)鍵合相色譜柱的合成第九張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端基封口：為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱端基封口，以提高鍵合相的穩(wěn)定性，改善脫尾。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)或覆蓋度來表示。覆蓋度：指參與反應(yīng)的硅羥基數(shù)目占硅膠表面硅羥基總數(shù)的比例。除硅碳雜化硅膠外，一般硅膠基質(zhì)的pH適用范圍為pH28，低pH引起鍵合相水解脫落，高pH引起硅膠溶解。化學(xué)

6、鍵合相色譜柱的合成第十張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月基質(zhì)的性質(zhì)普通硅膠填料：pH28，柱溫60聚合物填料：pH212，柱溫150雜化硅膠填料（XTerra,XBridge）：pH212，柱溫90Agilent柱：Ecilpse或StableBond ，pH13 ZORBAX Extend-C18，pH912,基質(zhì)的顆粒度顆粒度越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)，分離度越好，柱壓越高(滲透性差)，常用5?；|(zhì)的顆粒分布顆粒分布越寬:柱效低(滲透性差)基質(zhì)的顆粒形狀球型:柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型（不規(guī)則形狀）：柱床結(jié)構(gòu)不均勻,流動相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)展。化學(xué)鍵合相色譜

7、柱的性質(zhì)第十一張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月基質(zhì)的平均孔徑/孔體積平均孔徑與被測物分子量的關(guān)系化學(xué)鍵合相色譜柱的性質(zhì)第十二張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月含碳量含碳量越高，保留時間越長高含碳量 有利于不易保留的化合物的分離 水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好 有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量 有利于分析中性及堿性化合物 降低溶劑損耗化學(xué)鍵合相色譜柱的性質(zhì)第十三張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月硅膠的活性 主要影響堿性化合物的保留行為，活性高，保留時間長 生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同 是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量 重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小 是色譜

8、柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志端基封口 未封口會使堿性化合物拖尾備注：流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑。 化學(xué)鍵合相色譜柱的性質(zhì)第十四張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月鍵合相的性質(zhì) 鍵合相的極性：非極性、中等極性、極性 鍵合相的烷基鏈長非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。長的烷基鏈保護(hù)

9、了硅膠基質(zhì)，C18柱穩(wěn)定性較高；C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。化學(xué)鍵合相色譜柱的性質(zhì)第十五張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月鍵合相的性質(zhì) 內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合相（SymmetryShield RP、Bonus-RP）化學(xué)鍵合相色譜柱的性質(zhì)屏蔽了帶電的硅羥基降低堿性物質(zhì)的保留減少了拖尾改善與水的浸潤性無疏水塌陷，使用高比例水流動相時性能穩(wěn)定第十六張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月反相鍵合相色譜適用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。派生的反相離子對色譜以及離子抑制色譜，可以分離有機(jī)酸、堿、鹽這些離子型化合物。樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈

10、烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。第十七張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相為極性的水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。極性大的保留時間小，先洗脫。 分離機(jī)制：疏溶劑理論反相鍵合相色譜第十八張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月正相鍵合相色譜適用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。氰基鍵合相對雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性。氰基鍵合相分離選擇性與硅膠相似，極性小于硅膠，在相同條件下，同一組分的保留時間小于硅膠。氨基鍵合相具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對某些多官能團(tuán)化合物如甾體、強(qiáng)心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發(fā)生反應(yīng)生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。第十九張，PPT共二十一頁，創(chuàng)作于2022年6月流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、