高分子雜質(zhì)的檢查 PPT

1、高分子雜質(zhì)的檢查 PPT第1頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四檢查高分子雜質(zhì)的意義內(nèi)酰胺抗生素是臨床上常用的藥物之一。同時也是較易發(fā)生不良反應(yīng)的藥物之一。在臨床上最常見的不良反應(yīng)是速發(fā)型過敏反應(yīng)。引發(fā)內(nèi)酰胺抗生素速發(fā)型過敏反應(yīng)的過敏原并不是內(nèi)酰胺抗生素本身,而是其中存在的高分子聚合物。在六、七十年代就報道內(nèi)酰胺類抗生素溶液在室溫下放置幾天產(chǎn)生聚合物,其具有強的抗原性質(zhì),在臨床過敏反應(yīng)中起重要作用。經(jīng)近幾十年的研究也證明抗生素所致的過敏反應(yīng)抗生素是由其中存在的高分子聚合物產(chǎn)生的第2頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四高分子雜質(zhì)的含義及分類1.含義：高

2、分子雜質(zhì)：高分子雜質(zhì)是對藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱。它可能是聚合度不同的多組分混合體。2.分類：抗生素藥物中的高分子雜質(zhì)按其來源通常分為外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì):（1）外源性雜質(zhì)包括蛋白、多肽、多糖等類雜質(zhì),或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物,外源性雜質(zhì)一般來源于發(fā)酵工藝;（2）內(nèi)源性雜質(zhì)系指抗生素藥物自身聚合產(chǎn)物,聚合物可來自生產(chǎn)過程,又可在儲存中形成,甚至在用藥時也可由使用不當產(chǎn)生。第3頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四三種主要分離模式抗生素聚合物的免疫原性通常較弱,但作為多價半抗原,可引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)。因此需要控制其含量。近幾十年來國內(nèi)外對內(nèi)酰胺抗生素中

3、高分子聚合物的分離分析研究報道有許多,概括起來其分離的方法主要是色譜法,分離模式主要有三類: 凝膠過濾色譜法; 離子交換色譜法; 反相色譜法。第4頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四一.凝膠過濾色譜法凝膠過濾色譜法主要利用分子排阻的原理,即分子量差異進行分離的色譜模式。這對于分離藥物中的高分子聚合物是一種簡便易行的分離模式。在分離分析高分子聚合物的報道中,此類分離模式也是占主要部分。第5頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四凝膠色譜法原理凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而

4、測定蛋白質(zhì)的分子量也是它的重要應(yīng)用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這

5、些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。第6頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四第7頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四色譜柱在早期的報道中,運用凝膠色譜分離高聚物的色譜柱填料主要采用葡聚糖凝Sephadex G25。但后來報道中指出了Sephadex G25 對一些青霉素類藥物(如PL385)有強吸附作用,青霉噻唑酸的峰出現(xiàn)在聚合物峰的區(qū)域,氨基(amide) 共價體二聚物與青霉噻唑酸有相同的Kav 值,因此可干擾測定。第8頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37

6、分，星期四Kav即有效分配系數(shù)：表示分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系。 Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)： Kav = (VeV0)/(VtV0) 在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。第9頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四后來又有人使用Sephadex LH60 ，雖然對PL385 無吸附作用，但因Sephadex LH60 分離度低,因此也不用于分離聚合物?？傊?，以上報道的分離、分析方法因

7、操作繁瑣,實驗誤差大等原因,難于滿足質(zhì)量控制的需要。因此，近期的報道中主要采用葡聚糖凝膠SephadexG10 填料,其分子排阻量為700 道爾頓(葡聚糖) 。第10頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四Sephadex G-10 葡聚糖凝膠分子結(jié)構(gòu)第11頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四(1)葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是指由天然高分子葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech 生產(chǎn)。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex 和Sephacryl。葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex 系列，它是葡聚糖與3氯1

8、，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)相互交聯(lián)而成，交聯(lián)度由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號是G-10 G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 干膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干膠。Sephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。Sephadex 中排阻極限最大的G-200為8105。第12頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四第13頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四Sepha

9、dex 在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復(fù)使用。Sephadex 穩(wěn)定工作的pH 一般為210。 但酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex 與強酸和氧化劑接觸。 Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應(yīng)，形成LH 型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機溶劑為流動相，分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。 第14頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四胡昌勤等運用葡聚糖凝膠Sephadex G10 分離分析內(nèi)酰胺抗生素中的高聚物并進行了一系

10、列的報道，闡述了各種色譜條件對內(nèi)酰胺抗生素在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為的影響,指出:溶質(zhì)的解離主要與流動相中緩沖鹽的種類和濃度以及pH值有關(guān),具體如下：第15頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四當流動相中離子種類不變,離子強度越大,內(nèi) 酰胺抗生素的Kav 值越大;緩沖液中的陰離子種類,陰離子所帶的負電荷越多,溶質(zhì)的Kav 值相對越大,色譜峰越易拖尾; 當流動相中有多元酸/ 鹽存在時,pH 通過影響多元酸的解離,改變緩沖液中陰離子類型來改變?nèi)苜|(zhì)的保留行為; 流動相的pH 也可通過影響溶質(zhì)的解離狀態(tài)來影響溶質(zhì)的保留行為。對側(cè)鏈中含有氨基的溶質(zhì),流動相的p

11、H 可直接影響氨基的質(zhì)子化狀態(tài)。在酸性條件下氨基主要以NH3+ 的形式存在,在堿性條件下氨基主要以NH2 的形式存在,第16頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四報道中還指出了內(nèi)酰胺抗生素在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中，色譜行為的定量關(guān)系; 有目的地利用了溶質(zhì)與 Sephadex G10 凝膠介質(zhì)間的相互作用在凝膠顆粒內(nèi)、外有較大差異這一現(xiàn)象,通過選擇適當?shù)牧鲃酉嗍箖?nèi)酰胺抗生素和其高聚物達到分離。第17頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四同時其利用在特定情況(純水、0. 5 % 葡萄糖溶液或0. 01mol/ L 甘氨酸溶液為流動相時即藥典

12、上所說的流動相B)內(nèi)酰胺抗生素可以締合形成表觀分子量較大的締合物,締合物在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為和高分子雜質(zhì)一樣,Kav = 0 處表現(xiàn)為單一色譜峰這一特點,采用了自身對照外標法對高分子雜質(zhì)進行精確定量,解決了無高分子雜質(zhì)對照品和溶質(zhì)主峰十分寬大(如下圖),致使一般積分儀難于準確積分的問題。第18頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四圖1 高分子聚合物峰形圖Fig 1 The peak of high molecular weight impurities第19頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四中國藥典從2000 年版起收載

13、頭孢哌酮鈉、頭孢曲松鈉、頭孢他定、頭孢噻肟鈉四個品種高分子聚合物的測定,方法均采用Sephadex G10 自身對照外標法；而中國藥典2005版在此基礎(chǔ)上又增加了頭孢拉定、頭孢呋辛鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢噻吩鈉、以及青霉素鈉和青霉素V鉀的高分子聚合物的測定，其方法也同樣采用的是自身對照外標法。第20頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四自身對照外標法原理：在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中，由于Sephadex G10 的排阻分子量僅為700d,因此，除部分寡聚物外， 內(nèi)酰胺抗生素中 的高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜 峰，其Kav =

14、 0 。在特定的條件下， 內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵，靜電相互作用，疏水相互作用等次級相互作用，可以形成締合物，導(dǎo)致其表觀分子量增大，此時在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在Kav = 0 處表現(xiàn)為單一的色譜峰。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四利用此原理，在Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)中，以藥物自身為對照品，測定其在特定條件下締合時峰的相應(yīng)指標，再改變色譜條件，測定樣品中高分子雜質(zhì)和藥物分離后在Kav = 0 處的峰相應(yīng)指標，按外標法計算，即得藥品中的高分子雜質(zhì)相當于藥品本身的相對含量。下面討論色譜條件與系統(tǒng)

15、適應(yīng)性試驗。第22頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四試驗條件的選擇一.流動相種類和濃度的選擇流動相的種類與其濃度可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行 為，實驗證明，反離子PO 43-明顯地改變頭孢菌素在SephadexG-10中的色譜行為。中國藥典2005版最常用的流動相A是0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉 61：39），濃度常為0.1、0.01mol/L以及其他濃度，另外也有選用檸檬酸鹽、硫酸銨或磷酸鹽作為流動相。第23頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四流動相B的選擇流動相B常常采用純水，或者001 十二烷基硫酸鈉，05 的葡萄糖溶液也常

16、被作為締合峰測定的基本洗脫液。在此條件下， 內(nèi)酰胺抗生素可以締合形成表觀分子量較大的締合物,從而表現(xiàn)出與高分子雜質(zhì)相似的性質(zhì)，可以作為自身對照溶液的洗脫條件。不過注意溫度和時間的影響，需現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗中發(fā)現(xiàn)當對照溶液配制過久，出現(xiàn)的峰形容易拖尾，有可能是締合峰隨時間的增加解離的結(jié)果。第24頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四二.流動相A pH的選擇 流動相的pH 對溶質(zhì)的保留行為也有影響，通常情況下，pH 和K av間基本呈線性關(guān)系。堿性和偏堿性及酸性條件下頭孢菌素極易發(fā)生聚合反應(yīng)，其測得的高分子聚合物難以反映樣品本身的實際含量。一般采用pH7.0，有的也采用 pH8.0

17、或者 pH6.0。主要通過實驗來確定。第25頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四三.流速的選擇中國藥典2005版測定高分子雜質(zhì)常用的流速有1.5、1.0、0.8ml/min等，在做磺芐西林鈉實驗中，我嘗試過1.2 、1.0 以及0.8ml/min不同的流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用1.0ml/min對磺芐西林鈉主峰和高分子雜質(zhì)的分離最好，所以采用1.0ml/min作為測定的流速。第26頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四四.溫度的影響樣品中高聚物的含量較低, 高分子雜質(zhì)對溫度比較敏感。實驗中我們也發(fā)現(xiàn)柱溫箱設(shè)置不同溫度時,對雜質(zhì)含量和峰形均有一定影響。為保證檢測的準確度和重復(fù)性,實驗中應(yīng)注意控制溫度,且樣品處理后必須立即進樣,避免其他因素干擾雜質(zhì)測定的真性。第27頁，共31頁，2022年，5月20日，19點37分，星期四系統(tǒng)適應(yīng)性實驗用藍色葡聚糖2000做系統(tǒng)適用性試驗，其保留時間與柱效及拖尾因子等參數(shù)共同代表著色譜柱的性能。在2005年版藥典二部各品種高分子聚合 物測定方法項下的系統(tǒng)適用性實驗中，規(guī)定在兩種流動相系中藍色葡聚糖2000的保留時間(tRA， tRB)比值應(yīng)在093107之間；對照品測定的 保留時間(t )，供試品溶液中高分子聚合物的保 留時間(t ”)與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000 的保留時