液相色譜原理

1、高效液相色譜分析原理2009年05月12日 星期二17:46高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過 程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定 相為大于lOOum的吸附劑（硅膠、氧化鋁等）。這種傳統(tǒng)的液相色譜所 用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡單混 合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度?。?um-lOum）、傳質(zhì)快、 柱效高。高效液相色譜法（HPLC ）是20世紀(jì)6O年代后期發(fā)展起來的一種分 析方法。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分 離測定等應(yīng)用廣泛。世界上約有8 0%的有機(jī)化

2、合物可以用HPLC來分析測 定。高效液相色譜分析原理 （一）高效液相色譜分析的流程由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后， 導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離 后進(jìn)入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流 入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯 度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（二）高效液相色譜的分離過程同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一 種連續(xù)多次交換過程。

3、它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大 小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相 一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A 不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯 留時(shí)間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個(gè)流出 色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩 相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系 數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力

4、學(xué)平衡問題，也是分離的首要 條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩 相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有 關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。高效液相色 譜的類型 （一）吸附色譜在吸附色譜中，樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上， 非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位 置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的， 強(qiáng)離子樣品是不適宜的。吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ)，按照 樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃

5、度為10%或更少一些。 如有可能，可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦邼舛鹊拇紩p少填料的吸附活性，減 弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。（二）分配色譜1.正相分配色譜正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品，但 正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。2 .反相分配色譜 這種方法目前應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用的范圍也很廣， 在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。通過使用的流動(dòng)相是水一甲醇和水一乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不 同來調(diào)節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團(tuán)，需要在流動(dòng)相中加入鹽或調(diào)節(jié)流 動(dòng)相的PH值，例如，如果樣品有一個(gè)一COOH基團(tuán)，使流動(dòng)相的PH值 是偏向酸性的，由于抑制了一COOH基

6、團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。這個(gè)方法叫 離子抑止法，如果樣品有強(qiáng)離子基，有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當(dāng)抗衡離子 以形成離子對的離子對法。在調(diào)節(jié)PH值中，保持PH值在填料說明書手冊中所規(guī)定的范圍內(nèi)，大多 數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當(dāng)加入鹽以后，最好使其 PH=7. 5-8或更小的，多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的PH值。（三）離子交換色譜這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離 子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中，流動(dòng)相 的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在

7、高效液相色譜的 離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因?yàn)槁然飼g不銹鋼儀 器，在高效液相色譜中不能使用NaCI或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測量波長 有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當(dāng)檢測處在短波端的 時(shí)候，用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。（四）凝膠色譜凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑 的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。因?yàn)樵跇悠分校〕叽绲姆肿由钌畹貪B透到微孔中，所以遲流出，而大尺 寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑 作流動(dòng)相，叫做凝膠滲透色譜

8、。凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。1.凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatogr aphy)，簡稱GPC。此一類的色譜，使用于有機(jī)性溶媒的樣品中，如P VC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform2 .凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜(Gel Filtrarion Chromatogr aphy)，簡稱GFC。此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋 白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機(jī)膠和無機(jī)膠。按其制備的方法 又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠

9、的強(qiáng)度又可分為軟膠、 半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩 性凝膠等等。高效液相色譜法在分析檢測上的應(yīng)用(一)食品中山梨酸、苯甲酸的測定1.原理樣品加溫除去二氧化碳和乙醇，調(diào)PH至近中性，過濾后進(jìn)高效液相色譜 儀，經(jīng)反相色譜分離后，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性和定量。2 .試劑和溶液方法中所用試劑，除另有規(guī)定外，均為分析試劑，水為蒸餾水或同等純度 的水，溶液為水溶液。甲醇：優(yōu)級純，如果是分析純，需重蒸。稀氨水：1 + 1溶液，氨水加水等體積混勻。0.02mol/L乙酸鉸溶液：稱取154g乙酸按，加水至1OOOmL，溶解，經(jīng)濾膜(0.45m)過濾。（4）20g/L

10、碳酸氫鈉溶液：稱取2 g碳酸氫鈉（優(yōu)級純）加水至1OOmL，振搖溶解。（5）苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0. 1 0 0 0 g苯甲酸，加20g/ L碳酸氫鈉溶液5mL，加熱溶解，移入10 0mL容量瓶中，加水定客至 10 0mL，搖勻，此溶液苯甲酸含量為1mg/1mL，作為儲備液。（6）山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0. 1 0 0 0 g山梨酸，加碳酸氫鈉 溶液（2 0g/L）5mL，加熱溶解，移入10 0mL容量瓶中，加水定 容至10 0mL，山梨酸含量為1mg/1mL，作為儲備溶液。（7）苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶 液10. 0mL，放入10 0mL容量瓶中，

11、加水至刻度。此溶液含苯甲酸、 山梨酸各0.1mg/mL。經(jīng)濾膜（0.45m ）過濾（同時(shí)測定糖精鈉時(shí)， 可加入糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液）。3.儀器高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）。4 .測定方法（1）樣品處理1.汽水、飲料、果汁類：（汽水需微溫?cái)嚢璩ザ趸迹┪?. 0 mL樣品，加入已裝有中性氧化鋁（3 cm* 1 . 5cm）的小柱中，過濾， 棄去初濾液，然后用流動(dòng)相洗脫苯甲酸，接收于2 5mL帶塞量簡中，洗脫至 刻度，搖勻。此液通過微孔濾膜后進(jìn)樣。3.配制酒類：稱取10.0g樣品，放入小燒杯中，水浴加熱除去乙醇， 用氨水（1 + 1 ）調(diào)節(jié)PH約7,加水定容至適當(dāng)體積，經(jīng)濾膜（0 .45up）