核酸提取及常見問題分析

1、核酸提取及常見問題分析第1頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第2頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作 。前言第3頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策第三部分：RNA

2、提取方法簡介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第一部分：DNA提取方法簡介第4頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法其它第5頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四DNA提取的幾種方法非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法第6頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四基因組DNA CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium b

3、romide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于15。第7頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/

4、V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA CTAB法第8頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四CTAB提取緩沖液的改進配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%

5、（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA CTAB法第9頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA CTAB法第10頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四 SDS法原理基因組DNASDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（

6、冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取緩沖液第11頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四 SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNASDS法第12頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四基因組DNA其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學方式：異硫氰

7、酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法根據(jù)細胞裂解方式的不同有：第13頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四基因組DNA其它方法吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。第14頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四基因組DNA其它方法濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作

8、用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物第15頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第16頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分

9、重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液第17頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四質(zhì)粒DNA煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第18頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四細胞器DNA差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不

10、同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。第19頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策第2

11、0頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第21頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選

12、擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）第22頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機械法處理，以破壁第23頁，共49

13、頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取第24頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理第25頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶

14、解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。核酸分離、純化第26頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70的乙醇洗滌第27頁，共49頁，2022

15、年，5月20日，5點28分，星期四核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取第28頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，

16、去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。 原因?qū)Σ叩?9頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，

17、避免反復凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策 原因第30頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策 原因第31頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策內(nèi)

18、容第三部分：RNA提取方法簡介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第三部分：RNA提取方法簡介第32頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四RNA提取的通用方法異硫氰酸胍/苯酚法 原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。 RNA提取的通用方法第33頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四異硫氰酸胍/苯酚法 步驟:材料準備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫

19、胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。RNA提取的通用方法第34頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四影響RNA提取的因素 材料：新鮮，切忌使用反復凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于70或20保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，70短期保存影響RNA提取的

20、因素第35頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四影響RNA提取的因素 樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图毦阂话鉚RIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當加大裂解液的用量影響RNA提取的因素第36頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四 純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成 RN

21、A 降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素第37頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四第一部分：DNA提取方法簡介第二部分：DNA提取常見問題、原因分析及其對策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策第38頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四RNA提取常見問題 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 電泳帶型異常 下游實驗效果不佳第39頁，共49

22、頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四RNA降解 新鮮細胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等)，很難避免 RNA 的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。第40頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四RNA降解 冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預冷，碾磨過程中及時補充液氮。第41頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四OD26

23、0 /OD280 比值偏低 蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第42頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四OD260 /OD280 比值偏低 抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮 RNA，并且徹底去掉 75% 乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。 設(shè)備限制：測定OD260 及OD280 數(shù)值時，要使OD260 讀數(shù)在 0.10

24、 - 0.50 之間。此范圍線性最好。 用水稀釋樣品：測 OD 時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作為稀釋液將導致比值的降低。 第43頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四電泳帶型異常 非變性電泳：上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導致 28S 和 18S 條帶分不開。 變性電泳條帶變淡： EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高 。第44頁，共49頁，2022年，5月20日，5點28分，星期四下游實驗效果不佳 RNA 降解 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 第45頁，共