亞硫酸鹽還原菌及檢測

1、亞硫酸鹽復(fù)原菌及檢測一、生物學(xué)特性與衛(wèi)生學(xué)意義亞硫酸鹽復(fù)原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細(xì)菌，而不是一個生物學(xué)分類單位。多指厭氧芽胞桿菌，代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌，其他常見的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。此類細(xì)菌的主要特征是將亞硫酸鹽復(fù)原為硫化物，多為有動力的革蘭氏陽性菌，可形成芽胞，厭氧生長。厭氧亞硫酸鹽復(fù)原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在，通常消滅在人和動物的糞便排泄物，廢水和土壤中。與大腸桿菌和其它桿菌不同的是，由于它們的孢子比養(yǎng)分體對物理和化學(xué)因子具有更強(qiáng)的抵抗力，所以可以在自然環(huán)境中存活很大時間。因而，通常將他們作為長期污染或連續(xù)污染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處

2、理所用氯的工作濃度，因此，它們對推斷是否已到達(dá)把握目的格外有用。由于此類細(xì)菌抵抗力強(qiáng)，即使在經(jīng)適當(dāng)加工處理的加工食品中其芽胞仍會存活，條件適宜時又會生長生殖，造成食品品質(zhì)降低或腐敗，甚至?xí)鹗澄镏卸镜奈＜?。因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠環(huán)境衛(wèi)生把握上頗受重視，作為食品、礦泉水、加工設(shè)備衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況的評估指標(biāo)，正確得到越來越廣泛的應(yīng)用。該類細(xì)菌的檢測多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評估，在九十年月中后期開頭在食品衛(wèi)生領(lǐng)域中有所要求，但多局限于歐洲國家和地區(qū)，如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國。到目前為止，該菌一般不被作為食品衛(wèi)生常規(guī)檢測工程和致病菌檢測內(nèi)容，我國和美國未

3、將該檢測工程列入食品微生物檢測工程和要求中。二、檢測方法由于此類細(xì)菌以形成芽胞、厭氧生長和復(fù)原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征， 往往無需作進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，因此在檢測中將滿足以上三個條件的一群細(xì)菌全部認(rèn)定為厭氧亞硫酸鹽復(fù)原菌。檢測方法一般包括以下三局部：檢樣在接種前在 80-100水浴中處理 10-15 分鐘，以殺滅抵抗力弱的芽胞細(xì)菌的養(yǎng)分體，同時刺激芽胞的生殖；通過選擇性培育如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有復(fù)原亞硫酸鹽的力量，假設(shè)有則進(jìn)一步與培育基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反響，使菌落呈現(xiàn)黑色；培育基接種后置于厭氧環(huán)境中培育確認(rèn)厭氧特征。也可在培育基中參加抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽復(fù)原菌的生長。下面

4、具體介紹亞硫酸鹽復(fù)原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。培育基和試劑氯化鈉胰蛋白胨稀釋液亞硫酸鐵瓊脂過氧化氫試劑儀器和設(shè)備均質(zhì)器:用于處理固體樣品培育罐箱,帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設(shè)備或試劑2.3 恒溫培育箱:371或 461振蕩器吸管:1mL、10mL,具 0.1mL 刻度培育皿:直徑為 90mm稀釋瓶:容量為 500mL 和 250mL 的廣口瓶天平:感量 0.1g 3.抽樣和試樣制備抽樣參照 SN0330-94 規(guī)定抽樣試樣制備無菌操作稱取剪碎后的樣品 25g,置于裝有 225mL 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中。假設(shè)檢測亞硫酸鹽復(fù)原梭菌的芽胞,可 75 20min 或煮沸保持 10min 熱處理樣品,之后

5、以流水快速冷卻至室溫后再稱取。充分混勻后據(jù)樣品污染狀況做進(jìn)一步的系列十倍梯度稀釋。檢驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)法適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽復(fù)原梭菌計(jì)數(shù)10g(mL)的食品。接種和培育對每一份試樣，選用適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取 1 mL，一式雙份地接種于每個滅菌的培育皿中。傾注約 15 mL 制備好的并于水浴箱保溫至 45的亞硫酸鐵瓊脂。從制備最初稀釋液完畢到傾注培育基于最終一個平皿所用的時間不應(yīng)超過 15min。認(rèn)真將接種物和培育基充分混勻，水平放置，使其凝固。待混合物凝固后，在傾注 10 mL 同樣的培育基于已凝固的培育基上作為隔層以防氧吸附，并防止細(xì)菌集中生

6、長。待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板，于 371厭氧培育 24-48h。假設(shè)對培育溫度有特別要求如 46，可依據(jù)狀況進(jìn)展培育。計(jì)數(shù)亞硫酸鹽復(fù)原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。371厭氧培育 24h 后，計(jì)數(shù)典型的菌落；假設(shè)平板上無特征性菌落或菌落較小0.5mm， 則需連續(xù)培育 24h 再計(jì)數(shù)；假設(shè) 48 h 后的菌落增大以至相連，則以 24 h 的計(jì)數(shù)為準(zhǔn)，反之則以 48h 為準(zhǔn)。那些僅產(chǎn)生氫而不是 H S的厭氧菌生長時也可復(fù)原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培育2基消滅彌散的、非典型的普遍變黑，這種現(xiàn)象不應(yīng)計(jì)數(shù)。取特征性菌落不少于 5 個移種于皰肉培育基中，371厭氧培育24-72 h。待消滅生長特征培

7、育液渾濁、產(chǎn)氣、消滅異味后，按 5 條進(jìn)展證明試驗(yàn)。對陽性結(jié)果進(jìn)展計(jì)數(shù)。讀取帶有 10-100 個黑色菌落的平皿，結(jié)果以相應(yīng)稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)來計(jì)算每克樣品中亞硫酸鹽復(fù)原梭菌數(shù)。結(jié)果報告如下：估量亞硫酸鹽復(fù)原梭菌數(shù)/g(mL)。假設(shè)相應(yīng)測試試樣的兩個平板上均無特征性菌落，以10/g(mL)報告最近似值MPN法適用于檢查亞硫酸鹽復(fù)原梭菌計(jì)數(shù)10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽復(fù)原梭菌的加工食品。接種和培育增菌選用適宜的三個連續(xù)稀釋的樣液，從每個樣液中分別吸取 1mL，一式三份地接種于 3 管裝有皰肉培育基的試管中,接種后上面掩蓋一層無菌的液體石蠟，371培育 24-

8、72h。待消滅生長特征培育液混濁、產(chǎn)氣、消滅異味后,按 5.1條進(jìn)展鏡檢。反之，則報告陰性。分別培育取 4.2.1.1 增菌培育物 1mL 置于滅菌的培育皿中，傾注約 15mL45的亞硫酸鐵瓊脂。認(rèn)真將接種物和培育基充分混勻，待其凝固后，再傾注 10mL 同樣的培育基作為隔層，于 371厭氧培育 24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5 條加以證明；反之，則報告陰性。結(jié)果計(jì)算計(jì)數(shù)每個稀釋度得到的陽性反響管數(shù)。利用 MPN 表，由陽性管數(shù)估算每克毫升試樣中亞硫酸鹽復(fù)原梭菌最近似值。結(jié)果報告如下：估量亞硫酸鹽復(fù)原梭菌數(shù)/g(mL)。證明試驗(yàn)形態(tài)觀看取皰肉培育物涂片，鏡檢，作革蘭氏染色，檢查培育物

9、細(xì)菌形態(tài)。亞硫酸鹽復(fù)原梭菌為革蘭氏陽性桿菌，單個散在，成對、成小鏈狀或并列地聚堆存在。產(chǎn)芽胞時，芽胞呈卵圓形或球形，位于中心、次終端或終端。過氧化氫酶試驗(yàn)在干凈載玻片上滴 1 滴培育物，再滴加 1-2 滴 3% 的過氧化氫。消滅小氣泡說明有過氧化氫酶活性。亞硫酸鹽復(fù)原梭菌不形成過氧化氫酶。附錄：A1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液將 8.5g 氯化鈉和 1.0g 胰蛋白胨溶解于 1000 mL 蒸餾水中。調(diào)整 pH 至 7.20.1。分裝 225 mL 于 250 mL 廣口瓶中，121高壓滅菌 15min。A2 亞硫酸鐵瓊脂胰蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 5.0g偏重亞硫酸鈉 1

10、.0g檸檬酸鐵銨 1.0g瓊脂 20.0g蒸餾水 1000g將各成分混勻，加熱溶解，調(diào)整 pH 至 7.60.1，分裝于 500 mL 錐形瓶中各 250 mL，121高壓滅菌 15 min。一周內(nèi)用完。A3 皰肉培育基牛肉浸液 1000 mL蛋白胨 30.0g酵母浸膏 5.0g 磷酸二氫鈉 5.0g 葡萄糖 3.0g可溶性淀粉 2.0g碎肉渣 適量取碎肉渣分裝 15mm150mm 試管約 2-3cm 高，將上述液體培育基分裝至每管內(nèi)超過肉渣外表約 1 cm。121高壓滅菌 15 min。A4 過氧化氫酶試驗(yàn)挑取培育物一接種環(huán)，置于干凈載玻片上，滴加 3%過氧化氫溶液臨用時配制2mL，于半分鐘

11、內(nèi)觀看發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。耶爾森氏菌及檢驗(yàn)耶爾森氏菌屬包括 11 個種，其中對人有致病性的有三種：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核菌已確定是食源性病原體。鼠疫耶爾森氏菌引起黑疽病，不通過食品傳染。1981 年依據(jù) DNA 以及生化和形態(tài)特征的相關(guān)資料，與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌極為親熱 3 個同源群被作為耶爾森氏菌的種命名，它們是弗氏耶爾森氏菌Yfrederiksenii、中間型耶爾森氏菌Yintermedia和克氏耶爾森氏菌Ykrislensenii。一、生物學(xué)特性1、形態(tài)特性本菌為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，大小為 1-3.50.5-1.3

12、m，多單個散在， 有時排列成短鏈或成堆。本菌不形成芽胞，無莢膜，有周鞭毛；但其鞭毛在 30 以下培育條件形成，溫度較高時即喪失，因此表現(xiàn)為 30以下有動力，而 35 以上則無動力。2、培育特性本菌生長溫度為 30-37，但在 22-29才能使本菌的某些特性消滅。4時能保存和生殖。本菌世代時間長，最短亦需 40 分鐘左右。在 SS 或麥康凱瓊脂上于 25經(jīng) 24 小時培育，菌落細(xì)小，至 48 小時直徑才增大成 0.5-3.0mm。菌落圓整、光滑、潮濕、扁平或稍隆起，透亮或半透亮；在麥康凱瓊脂上菌落淡黃色， 如假設(shè)微帶紅色，則菌落中心的紅色常稍深。本菌在肉湯中生長呈均勻混濁，一般不形成菌膜。3、生化特性氏菌表一：本菌的生化特性及其與近緣菌的鑒別反 應(yīng)鼠 疫耶氏菌假結(jié)核耶氏菌小腸結(jié)腸炎耶氏菌中間型耶費(fèi) 氏耶氏菌克 氏耶氏菌賴氨酸-精氨酸-鳥氨酸-+動力(22-26)-+動力(35-37)-尿 素-+苯丙氨酸-脫氨基酶甘露醇+山梨醇+/-+纖維二糖-+核