抗肝損傷與肝纖維化藥實驗法

1、第48章抗肝損傷與肝纖維化藥物實驗法2010.41肝臟是人體最大的腺體，位于腹腔的右上方。分左葉、右葉、方葉及尾狀葉四個葉。肝臟功能 代謝功能 (合成多種蛋白質(zhì)和脂類) 膽汁分泌（有助脂肪的消化和吸收)） 解毒功能 防御功能 參與凝血及抗凝血 造血功能（胚胎時期)2肝臟的細胞:實質(zhì)細胞(肝細胞)及非實質(zhì)細胞(肝星狀細胞枯否細胞pit細胞竇內(nèi)皮細胞 )Pit細胞大顆粒淋巴細胞-位于肝血竇內(nèi)的Nk細胞。 3 第1節(jié) 急性肝損傷動物模型作用：篩選改善肝細胞損傷的藥物并評價其活性主要內(nèi)容：1.四氯化碳肝損傷動物模型2.急性氨基半乳糖肝損傷動物模型3.急性對乙酰氨基酚肝損傷動物模型4.急性乙醇性肝損傷動

2、物模型 5.大鼠肝缺血-再灌注模型41. 四氯化碳肝損傷動物模型 【原理】 1)CCL4對肝細胞膜直接溶解作用。 2) 活性代謝產(chǎn)物對肝細胞的損傷。CCL4在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細胞色素P450酶的代謝，生成活潑的三氯甲基和氯自由基。 與細胞內(nèi)和細胞膜的大分子發(fā)生共價結(jié)合，膜脂質(zhì)過氧化，膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性被破壞； 抑制細胞膜及線粒體膜上鈣泵的活性, 胞漿Ca2+升高，Ca2+-ATP酶激活, ATP耗竭導(dǎo)致肝細胞損傷壞死。5 動物：以大鼠使用最多，雌雄兼用，280g左右。 方法： 大鼠一般以CCL4原液1 mlkg體重一次性ip或sc注射。也可經(jīng)ig給藥，0.8-1.6mlkg，配成1:11:3

3、橄欖油或精制花生油稀釋后ig。 小鼠對CCL4亦較敏感，配成1橄欖油或精制花生油稀釋液，按10-20mlkg ig或ip注射。 觀察指標： 1.給CCL4后16-24h處死動物，測定血清ALT和AST（）變化，甘油三酯(GT )、乳酸脫氫酶(LDH )、總膽酸(TBARS )及肝指數(shù)升高, 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)（檢測試劑盒）。 2.肝病理形態(tài)學(xué)檢查。 6【注意事項和評價】 (1)此模型是一種經(jīng)典的實驗性肝損傷模型。形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)壞死和脂肪變性，轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST升高，并能靈敏地反映肝損傷的程度。ALT和AST 16-24h后達到高峰，升高十倍左右，90h后可恢復(fù)

4、到正常范圍。 （2）可先給藥物7-10天，以評價藥物對肝損傷的保護。 (3) CCL4可由呼吸道、皮膚吸收，對人體有一定的毒性，注意個人防護。78 2.急性氨基半乳糖肝損傷動物模型 【基本原理】 氨基半乳糖(Galactoamine，GalN) ，常用其鹽酸鹽，生理鹽水溶解。 機制：GalN屬間接肝毒劑，肝損傷與其在肝內(nèi)的代謝及隨后對核酸合成的影響有關(guān)。GalN引起肝細胞壞死。分為三個步驟：第一步，GalN在肝內(nèi)代謝引起VDP-葡萄糖胺的聚積，同時引起尿嘧啶核苷酸和UTP（尿苷三磷酸）缺乏；第二步，這些代謝異常引起肝細胞膜損傷；第三步，鈣離子內(nèi)流增加破壞細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，進而引起代謝紊亂，導(dǎo)致細胞

5、的死亡。9(1)動物：大鼠，250350g，雌雄兼用。(2)方法：將GalN以無菌生理鹽水配成10溶液，1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，ip一次性注射500-850mgkg（大于1000mgkg，引起廣泛性肝壞死）。(3)檢測指標：給藥16-24h處死動物，測定血清ALT （）和AST（）， GT ( )、 LDH ( )、TBARS ()及肝指數(shù)() 。 肝病理形態(tài)學(xué)檢查。10【評價】(1) 小鼠不敏感。(2) GalN與CCl4所致肝損傷的組織學(xué)變化顯然不同。GalN損傷則呈彌漫性的多發(fā)性片狀壞死，脂肪變性不如CCl4明顯，嗜酸性小體較多見，與病毒性肝炎所造成的損傷類似。GalN肝

6、毒性的專一性較佳，對人安全無毒。 GalN肝損傷模型是研究病毒性肝炎的發(fā)病機制及其藥物治療的較好模型。113急性對乙酰氨基酚肝損傷動物模型【基本原理】1.大劑量對乙酰氨基酚代謝中產(chǎn)生大量N-乙酰-對苯醌亞胺(NAPQI)，超過了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQ I與生物大分子共價結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)巰基被氧化和芳基化而影響功能。2.對乙酰氨基酚在肝內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生自由基可引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，并通過破壞鈣穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生細胞毒性。12【操作步驟】 (1)動物：昆明小鼠，雄性，2535g。 (2)方法：將對乙酰氨基酚溶于40無菌生理鹽水，一次性ip注射300-500m g/kg，24h后取血。 (3

7、)觀察指標： 血清ALT和AST測定。 肝作組織學(xué)檢查。13【評價】(1)對乙酰氨基酚（撲熱息痛），乙酰氨基酚肝損傷是研究藥物性肝損傷的常用動物模型。(2)對乙酰氨基酚肝損傷的組織學(xué)變化主要表現(xiàn)以中央靜脈為中心的圓盤狀大量細胞壞死，但出血和脂肪變性不如CCL4肝損傷明顯。（3）大鼠對對乙酰氨基酚不敏感，小鼠十分敏感。144.急性乙醇性肝損傷動物模型 【基本原理】 1.大量飲酒除經(jīng)醇脫氫酶(ADH)氧化外，還可誘導(dǎo)微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS），催化乙醇產(chǎn)生乙醛毒性物質(zhì)。 2.乙醇誘導(dǎo)MEOS活性不但不能使乙醇氧化產(chǎn)生ATP，還增加氧和NADPH（還原型輔酶）的消耗，造成肝內(nèi)能量的耗竭，引起肝細

8、胞損害。15【試驗步驟】 （1）動物：雄性大鼠，180220g。（2）方法： ig 56度白酒，7ml/kg，每日2次。12周后表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性，伴輕度氣球樣變和炎細胞浸潤。（3）檢測指標：1.給CCL4 16-24h處死動物，測定血清ALT和AST（）變化，甘油三酯(GT )、乳酸脫氫酶(LDH )、總膽酸(TBARS )及肝指數(shù)升高, 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 。（檢測試劑盒） 肝病理形態(tài)學(xué)檢查 。 16【注意事項與評價】灌胃法造模符合人類飲酒習(xí)慣。用于酒精性肝損傷藥物篩選。175.大鼠肝缺血-再灌注模型【基本原理】 暫時阻斷肝血流，一段時間肝細胞并無明顯損傷，但隨后再灌注反

9、而出現(xiàn)損傷。發(fā)生嚴重缺血性損傷的細胞，再灌注不能使損傷減輕，反而使之加重。再灌注損傷的因素主要與自由基損傷和細胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。18缺血時，ATP大量分解，依次生成AMP腺苷次黃嘌呤黃嘌呤。黃嘌呤在黃嘌呤脫氫酶的作用下，經(jīng)非氧化的途徑進一步分解而生成尿酸。再灌時，由于細胞內(nèi)Ca2+突然增加，激活某種蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸福瑫r由于再灌注增加了氧的供應(yīng)，黃嘌呤便在黃嘌呤氧化酶的作用下，通過有氧氧化途徑生成尿酸，并生成大量氧自由基、羥自由基(OH)和H202。自由基和生物大分子作用，可使之受損。同時由于肝細胞內(nèi)Ca2+超載，使細胞膜及細胞器受損，細胞出現(xiàn)能量障礙。19【操作步驟】

10、(1)動物： 大鼠，200250g ， 。 (2)方法：戊巴比妥鈉(50mgkg)麻醉大鼠。打開腹腔，分離肝門靜脈、肝動脈和膽總管，用小型動脈夾將三者一同夾閉30一60min后，松開動脈夾讓血液重新灌注。 (3)觀察指標：分別于再灌流30min和60min取靜脈血測定血清ALT和AST活力。取肝組織，測定MDA含量。20第2節(jié) 小鼠免疫性肝損傷模型211. LSP誘發(fā)的小鼠自身免疫性肝炎 【基本原理】 肝細胞膜特異性脂蛋白(LSP)是一組大分子肝細胞膜脂蛋白抗原。 乙型病毒性肝炎患者血清中抗LSP持續(xù)陽性。 LSP是器官特異而非種屬特異。 小鼠LSP-1與兔肝細胞有交叉抗原性，故用兔LSP反復(fù)

11、免疫小鼠，可以引起機體產(chǎn)生高滴度的抗LSP抗體。 同時輔以人乙型肝炎疫苗等刺激，可誘發(fā)小鼠自身免疫性肝炎。22【操作步驟】 (1)分離LSP：日本大耳兔，放血處死，取肝，用pH8.0的蔗糖溶液制成50(w/v)的肝勻漿，4，105000g離心1 h，取上清液過分離柱，收集第1峰，濃縮、透析，即取得LSP；測定蛋白含量，置-20C，備用。(2)制作自身免疫性肝炎模型：C57 BL小鼠，雌性，202g，用兔LSP(0.5mgml)加等量弗氏不完全佐劑和人乙型肝炎疫苗(0.25ugm1)，sc 0.1 ml，每周一次，于第4次免疫后第7天處死，檢測血清抗LSP滴度和肝組織學(xué)變化。(3)血清抗LSP測

12、定：采用E LISA方法.23【注意事項與評價】LSP是一種弱抗原，不能誘發(fā)明顯的肝損傷。同時輔以人乙型肝炎病毒刺激，則可促進自身免疫性肝炎的產(chǎn)生。24 2.卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷 【基本原理】 預(yù)先給小鼠注射卡介苗(BCG),可使多核中性粒細胞或巨噬細胞聚集于肝，繼后再用低劑量大腸桿菌脂多糖(LPS)攻擊注射，可激發(fā)這些細胞釋放對肝細胞有毒性作用可溶性因子，造成免疫性肝損傷。25【操作步驟】 昆明種小鼠，雌性，243g。NS配制卡介苗溶液，每108活菌/ml ，尾靜脈0.2ml。 2h后ig給藥或溶媒，連續(xù)12d。12d后尾靜脈注入LPS （7.5ug/0.2ml）。禁食12h。

13、稱體重，摘眼球取血，離心(250g，20min)，收集血清，測ALT、AST。 另取:(1)肝臟、胸腺，稱重，計算肝和胸腺指數(shù); (2)肝左葉送病理組織學(xué)檢查; (3)每組取3只鼠，體外檢測脾細胞的ConA增殖 （4）檢測腹腔巨噬細胞分泌TNF與IL-1等。 26【注意事項與評價】(1)每批卡介苗所含活菌數(shù)有所差異，實驗前應(yīng)做活菌數(shù)的檢測。(2)由于卡介苗活菌數(shù)檢測不精確，且容易造成污染，可用滅活的短小棒狀桿菌（CP)替代。選模型方法是：給小鼠iv 0.5-1 mg CP，9天后iv 10ugLPS，12-16h后處死動物，采集血和肝臟標本進行檢測。273.鴨乙型肝炎病毒性肝損傷動物模型 【基

14、本原理】 由于受人乙型肝炎病毒(HBV)宿主專一，需尋找類似于HBV的其它動物肝炎病毒以用于研究。鴨乙型肝炎病毒(DHBV)與 HBV同屬于嗜肝DNA病毒科，因此DHBV感染的鴨可用于研究HBV致病機制和篩選抗肝炎病毒藥物的研究。28【操作步驟】(1) DHBV毒種獲取：從自然感染DHBV陽性的成年家鴨取血清，測定其DHBV滴度，根據(jù)與定量克隆DHBV DNA比較，計算每ml血清所含的病毒顆粒數(shù)，分裝在-70保存。(2)實驗用鴨：選血清斑點雜交試驗DHBV DNA陰性的北京雛鴨(1-3天內(nèi))。(3) 感染方法：接種病毒量在5108/ml（血清稀釋）。ip給予血清0.5ml。(4)觀察指標：30

15、日后處死，檢測血清和肝組織DNA提取物的DHBV DNA。29【注意事項與評價】(1)鴨種來源：不同鴨種對DHBV的易感程度有所差異，北京鴨對DHBV易感。(2)DHBV接種時機：鴨胚孵化1-5天內(nèi)的雛鴨及5天后的小鴨或成年鴨。接種時鴨齡越大，感染維持的時間即越短，但鴨胚時期接種病毒技術(shù)要求很高，雛鴨的孵出率難控制，故多認為孵出后l3天內(nèi)(多選擇24h內(nèi))接種病毒時機最佳。(3)接種途徑：DHBV接種途徑包括：iv，ip，im，肝內(nèi)注射il，胚內(nèi)注射ie等。一般認為，在其它條件相同的條件下，ip，iv，ie接種感染率最高，im接種次之，最可靠的方法可能為ip、il。30 (5)感染DHBV鴨肝

16、炎的評價：理想的感染DHBV鴨肝炎模型應(yīng)具備:血清中有持續(xù)穩(wěn)定的病毒癥即DHBV DNA(+)，鴨肝內(nèi)應(yīng)有DHBV DNA或(和)DNAP。感染了DHBV的家鴨其血清DHBV DNA和DHBV DNAP的水平在整個持續(xù)感染期間有很大的波動性，甚至可以出現(xiàn)暫時的轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，但此時肝組織DHBV DNA的檢測仍能夠顯示出乙肝病毒的感染狀態(tài)，因此，肝組織病毒DNA的檢測比血清病毒DNA的檢測更具重要性，更能可靠地反映出病毒感染的真實情況。314.刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠急性免疫性肝損傷模型 【基本原理】刀豆球蛋白A(Con A)是植物性蛋白的一種。給小鼠靜脈注射Con A后，可激活T淋巴細胞，導(dǎo)致與人類自身

17、免疫性肝炎相似的肝損害。Con A進入小鼠體內(nèi)后可使肝臟中NO合成酶及TNF-、INF-表達增高，而TNF-和INF-可激活iNOS系統(tǒng)，從而使NO合成增加導(dǎo)致肝損傷。32【操作步驟】（1）動物：79周齡小鼠，體重1825g。（2）方法：Con A溶解于生理鹽水中，以1030mg/kg的劑量（0.3ml）一次尾靜脈注射。（3）觀察指標：Con A注射后24小時取小鼠血清和肝臟，測定小鼠血清中ALT和AST活力，并取肝作組織學(xué)檢查。【注意事項】多數(shù)小鼠對Con A敏感而發(fā)生自身免疫性肝炎，但免疫缺陷小鼠和無胸腺裸鼠對Con A不敏感。33 第3節(jié) 脂肪性肝病脂肪性肝病包括乙醇性肝病和非乙醇性脂肪

18、性肝病。研究其發(fā)病機制、評價診斷方法、篩選防治該病的有效藥物的理想動物模型應(yīng)具備：1）人類脂肪性肝病的特征；2) 病變有一定發(fā)展過程，從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化至最終的肝硬化有相對明顯的分期，符合人類脂肪肝的演變過程；3) 簡便易行，模型形成率高，死亡率低；4) 造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢，便于藥物干預(yù)試驗。34一、高脂飼料誘發(fā)的脂肪肝【基本原理】脂肪肝的發(fā)病主要為：進入肝內(nèi)的脂肪酸過多，TG的合成超過將其轉(zhuǎn)運出肝臟的能力；肝內(nèi)脂肪酸氧化障礙，利用減少，TG合成增加；VLDL的合成及分泌障礙，肝臟內(nèi)源性TG不能運出；脂蛋白代謝酶的活性下降等?！静僮鞑襟E】（1）動物： SD大鼠，雄性，20

19、0250g。（2）方法：每日ig高糖、高脂、高蛋白乳劑，乳劑組成見表（略），實驗開始14周乳劑ig 2.5、5、7.5、10ml/kg每周遞增，后2周持續(xù)10ml/kg，共6周。（3）觀察指標： 檢測血清ALT、AST、TG、HDL-C、LDL-C（低密度脂蛋白-膽固醇 ）、TG含量 肝組織作病理組織學(xué)檢查。35【注意事項與評價】（1）加入與豬油等量的植物油，更符合人類的膳食結(jié)構(gòu)，植物油富含多不飽和脂肪酸，易發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)可與抗谷胱甘肽等抗氧化劑的活性部位結(jié)合，減少對自由基的清除，引起二次攻擊的發(fā)生。（2）6周后，大鼠出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，肝細胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)充

20、滿大量脂肪空泡。部分造模動物甚至有輕至中度肝實質(zhì)炎癥，即成功復(fù)制出肥胖、高脂血癥、脂肪肝，甚至脂肪性肝炎模型。36二、低蛋白、乏膽堿高脂飲食脂肪性肝炎模型【基本原理】飼料中缺乏蛋白質(zhì)不能合成載脂蛋白，以致甘油三酯積存肝內(nèi)；膽堿缺乏引起磷脂酰膽堿合成不足，從而導(dǎo)致極低密度脂蛋白合成下降，無法將甘油三酯運出肝外，引起肝內(nèi)脂肪堆積，形成脂肪變性。【操作步驟】（1）動物：大鼠，雄性，200250g。（2）方法：缺乏蛋氨酸和膽堿的飼料喂大鼠。 飼料配方成分：蔗糖360g、右旋麥芽糖200g、豬油250g、植物纖維素50g、玉米粉50g、食鹽7.5g、黑豆30g、CaCO3 2.5g、MgO 1.5g、維

21、生素A15 000 U、維生素D2 1500U、維生素E 0.5g。（3）檢測指標：進行肝病理形態(tài)學(xué)檢查。37 【注意事項與評價】（1）第8天肝細胞內(nèi)有少量脂滴，第14天約1/3肝細胞含有細顆粒狀脂滴，第21天約2/3以上肝細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，第28天可見肝細胞內(nèi)充滿脂肪空泡。（2）此種模型與人類脂肪性肝炎改變相類似，但其造模方法與人類膳食情況不同，人類與嚙齒類動物不同，其肝臟不存在膽堿缺乏問題。38三、乙醇灌胃動物模型【基本原理】乙醇在乙醇脫氫酶的催化下脫氫氧化，使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱。乙醇可致磷酸甘油增多而促進甘油三酯合成，致使脂肪在肝細胞內(nèi)沉積；同時乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)

22、致肝細胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭；乙醇對CYP2E1的誘導(dǎo)可加重乙醇代謝產(chǎn)物的肝毒性，使肝臟內(nèi)皮細胞窗孔改變，導(dǎo)致肝細胞脂肪攝取增多，促進脂肪肝的形成。【操作步驟】（1）動物：大鼠，雄性，150170g。（2）方法：灌服50%(V/V）乙醇10ml/kg，每日2次，同時以10%的乙醇為唯一飲料。（3）檢測指標：14周后處死動物，進行肝病理組織學(xué)檢查?！驹u價】造模14周出現(xiàn)肝細胞脂肪變及乙醇性肝炎樣改變，可見肝臟間質(zhì)反應(yīng)性增生。39四、高脂飲食+乙醇灌胃動物模型【基本原理】高脂飲食可導(dǎo)致脂肪代謝異常；乙醇所造成的脂肪在肝臟中的堆積主要由于乙醇及其氧化產(chǎn)物與肝內(nèi)脂質(zhì)代謝的相互作用，

23、乙醇以及活性氧在線粒體損傷中起主要作用。可能因素：游離脂肪酸(FFA)輸送入肝增多； 肝臟合成FFA增加或TG合成增多； FFA在肝線粒體中的氧化減少； 肝臟分解脂肪的能力下降； 極低密度脂蛋白(VLDL)合成和分泌減少，致肝臟輸出TG的能力下降。40【操作步驟】（1）動物：大鼠，雄性，200220g。（2）方法：以乙醇+脂肪乳劑灌胃，bid，6周。造模前3天以30%(v/v)乙醇5g/(kgd）適應(yīng)性灌胃，自第4天起，每3天乙醇的濃度增加5%，劑量增加0.6g/(kgd），至乙醇濃度55%，劑量8g/(kgd）止。脂肪乳劑灌胃量10ml/(kgd）不變。（3）觀察指標：第6周末，麻醉，腹主動

24、脈采血，取肝臟相同部位，制備肝勻漿，進行病理組織學(xué)檢查。 檢測血清ALT、AST、ALP、TG、SOD、MDA、GSH-PX及肝勻漿TG、SOD、MDA、GSH-PX含量?！驹u價】6周后，大鼠出現(xiàn)典型脂肪肝病變：肝細胞腫脹，細胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴。41 第4節(jié) 肝纖維化動物模型肝纖維化是肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程，它是慢性肝病重要的病理特征，也是進一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)。理想的動物模型應(yīng)當是： 與人類疾病特征相似； 病變有一定的發(fā)展過程，即有明顯的肝纖維化形成過程的分期； 形成率高，死亡率低； 造模方法簡便易行。42 常用的肝纖維化動物模型1. C

25、Cl4誘發(fā)的肝纖維化模型 【基本原理】 四氯化碳(CCl4)在肝P450酶作用,形成三氯甲基自由基和氯自由基，啟動脂質(zhì)過氧化作用,損傷肝細胞。長期反復(fù)多次給予CCl4 ，可致肝內(nèi)纖維增生，并逐漸加重形成肝硬化。43【操作步驟】(1)實驗動物：大鼠，雄性，100-150g。 (2)造模方法：將CCl4與橄欖油或精制花生油按l：l比例配比。按CCl4 1mlkg，ig 2次/周，持續(xù)10周。 (3)觀察指標： 檢測血清總膽紅素、總蛋白、型膠原，型前膠原肽以及肝羥脯氨酸含量； 肝組織作HE染色和膠原纖維染色的病理組織學(xué)檢查。44【評價】 (1)灌胃法優(yōu)點在于CC4可直接經(jīng)門靜脈到達肝，1.5h肝內(nèi)即

26、可達最高水平，故宜采用這種給藥途徑。 (2)方法改進：單純CCl4造模方法簡單，但時間較長。改用ccl4+苯巴比妥的方法（誘導(dǎo)藥酶），縮短實驗周期。動物在飲用苯巴比妥(35mgd)，2周后，灌胃CCl4 ，開始劑量為0.04ml，以后按體重調(diào)整CCl4用量，1次/周。 用此方法縮短時間，早期肝纖維化4-6周形成，8-10周形成肝硬化。是目前常用的方法。452.異種血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型 【基本原理】 慢性肝病遷延不愈的本質(zhì)與免疫反應(yīng)有關(guān)。 異種血清作抗原，反復(fù)注射動物，在體內(nèi)形成抗異種血清蛋白的抗體，通過免疫復(fù)合物的形成而造成肝免疫反應(yīng)，激發(fā)肝內(nèi)靜止的貯脂細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并分泌膠

27、原，導(dǎo)致肝纖維化。46【操作步驟】 (1)血清蛋白皮下致敏階段：雄性大鼠，120-150g 。將人血白清蛋白用生理鹽水稀釋，與等量的不完全弗氏佐劑乳化。大鼠皮下多點注射，每次注射0.5ml(內(nèi)含清蛋白4mg)，共4次。前2次間隔14天，第3、4次間隔10天。末次致敏后10天，從大鼠尾靜脈抽血1 ml，用間接ELISA法測定血清抗人血白清蛋白抗體，取抗體陽性大鼠實驗。47 (2)血清蛋白尾靜脈攻擊階段：大鼠經(jīng)尾靜脈注射白蛋白，2次/周。第1周注射劑量為2.5mg只，以后每次攻擊增加0.5mg，直至4.5 mg，維持此劑量，至少2個月。 【注意事項與評價】 (1)致敏結(jié)束后，選擇抗人血清清蛋白抗體

28、陽性的大鼠作實驗。 (2)攻擊階段中所用血清蛋白的劑量影響模型形成時間和死亡率，增大血清蛋白劑量，可使實驗周期縮短，但增加動物的死亡率。483.豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化。方法：新鮮豬血，350g離心20min，制得血清，濾過除菌，-20保存。Ip 豬血清0.5ml(約含30mg蛋白質(zhì))，每周2次，共8周。該方法簡便，實驗周期較短。注射豬血清4周即見肝內(nèi)膠原纖維形成纖維束，8周后纖維化的動物數(shù)增多，第1 2周，即停止注射豬血清4周后，仍有明顯的纖維間隔存在，分割肝小葉形成假小葉。494.膽總管結(jié)扎致肝纖維化(肝硬化)動物模型 【基本原理】 肝外或肝內(nèi)膽管梗阻導(dǎo)致繼發(fā)性膽汁性肝硬化。采用膽總管結(jié)

29、扎，在狗、大鼠、兔、猴等動物中制作出實驗性繼發(fā)性膽汁性肝硬化模型。主要用于肝硬化的血流動力學(xué)研究。50【操作步驟】(1)動物：雜種狗，12-2 1 kg。 (2)實驗方法：無菌上腹正中切口，抬高肝緣，拉開十二指腸，分離膽總管2-3cm，穿刺抽出膽汁為準。在近十二指腸處和近膽囊處用4號絲線各結(jié)扎兩道，從中切斷膽總管。肌注青霉素80萬u天，3天，防感染。51(3)血流動力學(xué)檢查：結(jié)扎10周后，禁食12h。戊巴比妥鈉靜脈麻醉(25mgkg)，分別插入導(dǎo)管：經(jīng)股動脈插管監(jiān)測平均動脈壓(MAP)及心率(HR)；經(jīng)股靜脈插管至下腔靜脈監(jiān)測下腔靜脈壓(ICVP)；經(jīng)腸系膜靜脈插管至門靜脈。測門靜脈壓(Ppv

30、)；經(jīng)右頸外靜脈插管至肝靜脈，測定肝靜脈壓(FHVP)，嵌塞肝靜脈壓(WHVP)及肝靜脈壓力梯度(HVPG)。52【注意事項與評價】(1)插管前于管內(nèi)預(yù)先注入肝素防止凝血。各項指標均輸入多道生理記錄儀同步記錄。(2)膽總管結(jié)扎肝硬化動物模型制作方法簡單、周期較短。但有時膽管再通，組織學(xué)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，膽汁過度淤積及死亡率高。535.D-GalN致肝纖維化模型動物：大鼠，150-200g,雌雄兼用。方法：（1）生理鹽水配成10%的溶液, ip 250mg/kg, 一天一次。每周6次。（2）5個月，肝小葉出現(xiàn)紊亂, 增生的膽管及纖維母細胞向四周成星狀伸展;（3）6個月后,肝小葉結(jié)構(gòu)完全紊亂,被分割成多個

31、小結(jié)節(jié),周圍有結(jié)締組織包繞。 【評價】溶液配制簡便, 但該模型亦存在周期長等不足。546.乙醇誘導(dǎo)的肝纖維化模型【基本原理】乙醇代謝產(chǎn)物乙醛對肝臟產(chǎn)生直接損害，其中肝臟使輔酶I(NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原性輔酶I(NADH)，NAD/NADH比例下降使三羧酸循環(huán)受抑制，脂肪氧化減弱，肝內(nèi)脂肪酸合成增多，超過肝臟處理能力，形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。（1）動物：大鼠，180220g，雌雄兼用。 55方法：以低脂肪（占總熱量的7%）、高蛋白（占熱量的13%），并含一定的膽堿和糖類（占熱量的41%）的飼料喂養(yǎng)。起初3日給予大鼠2%的蔗糖溶液自由飲用，然后在2%的蔗糖溶液中加5%乙醇(v/v)，以后每隔4日

32、提高乙醇濃度5%直至15%，其后改為每周增加5%的乙醇濃度直至乙醇的終濃度為40%。造模16周出現(xiàn)肝腺泡III區(qū)輕度脂肪變，25周時肝脂肪變加重，并伴有肝細胞壞死、門管區(qū)炎性細胞浸潤和中央靜脈周圍纖維化?！咀⒁馐马椗c評價】（1）雌性造模大鼠肝脂肪變高于雄性，但肝病理學(xué)改變并無性別差異。（2）通過食用固體食物和以乙醇溶液作為飲料，飲食組成比例與人類接近，與人類乙醇性肝損傷相接近。567.二甲基硝胺（DMN）誘導(dǎo)的肝硬化【基本原理】二甲基硝胺具有肝毒性、細胞毒性和免疫毒性，長期給大鼠可導(dǎo)致肝實質(zhì)細胞發(fā)生廣泛壞死、纖維組織蓄積、肝臟萎縮、血清蛋白濃度下降、總膽紅素升高、血小板數(shù)減少等而導(dǎo)致肝纖維化、

33、肝硬化。57【操作步驟】 （1）動物：大鼠，雄性，180200g。（2）方法：ip 1%DMN生理鹽水溶液，10mg/kg，1周1次。34周后開始出現(xiàn)肝纖維化；注射5周后，肝臟有肝實質(zhì)纖維化的彌散性小結(jié)節(jié)分布；第6、7周時大鼠肝酷似人的肝硬化?！咀⒁馐马椗c評價】（1）此模型與人類肝硬化早期改變及膠原纖維沉積相似，可作為篩選抗纖維化藥物模型。（2）此模型癌變率較高。（3）環(huán)境污染嚴重。588.復(fù)合因素建立肝纖維化模型 【基本原理】高脂乳劑富含多不飽和脂肪酸，易發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基和醛類物質(zhì)，加速非乙醇性脂肪肝的形成。而CCl4 在肝內(nèi)經(jīng)混合功能氧化酶作用形成三氯甲基自由基，通過引發(fā)活性氧自由

34、基的產(chǎn)生，啟動脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致肝細胞損傷，誘導(dǎo)肝纖維化產(chǎn)生。富含多不飽和脂肪酸的花生油通過激活肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進CCl4引起的大鼠肝損傷，兩者協(xié)同，可加速脂肪性肝纖維化的形成。59【操作步驟】 （1）動物：大鼠，雄性，200220g。（2）方法：以高脂乳劑灌胃（1次/天），同時配以40%CCl4花生油溶液1ml/kg作背部后側(cè)皮下注射（2次/周）；每天給以足量的18%蔗糖溶液，自由飲用。（3）檢測血清ALT、AST、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、型膠原、型前膠原肽以及肝羥脯氨酸含量; 肝組織作HE染色和膠原纖維染色的病理組織學(xué)檢查。 60【評價】（1）復(fù)合因素作用于動物，可以縮短造模時間，提

35、高成功率。（2）6周可見肝細胞點狀及點灶狀壞死、匯管區(qū)炎性細胞浸潤、周圍纖維輕度增生等早期纖維化癥狀表現(xiàn)；8周表現(xiàn)出肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，炎性細胞浸潤，間質(zhì)纖維組織增生等明顯的肝纖維化癥狀。61第5節(jié) 離體大鼠肝灌流方法 【基本原理】 離體大鼠肝灌流技術(shù)是在麻醉狀態(tài)下用外科手術(shù)使肝形成體外循環(huán)，由蠕動泵將氧飽和的特定灌流液恒速壓入循環(huán)管道，流經(jīng)過濾裝置、加溫裝置、門靜脈套管到肝，從上腔或下腔靜脈流出，流出液可取樣進行分析或再流回貯液池進行再循環(huán)。在一段時間內(nèi)使離體肝維持其正常的生理和生化功能，在人工控制劑量和排除整體影響的條件下，動態(tài)地研究藥物及其他化學(xué)物質(zhì)在肝的代謝規(guī)律及其對肝功能的

36、影響。62【實驗材料】（1）灌流儀：灌流儀有以下幾個組成部分：蠕動泵與醫(yī)用硅橡膠管系統(tǒng)，貯液槽與氣體交換裝置，控制灌流系統(tǒng)的隔水式恒溫裝置，可除去灌流液中破碎細胞或其他凝集物的過濾裝置。（2）灌流介質(zhì)：人造灌流液進行灌流。 1）無紅細胞的人造灌流液。 2）含紅細胞的灌流液。63【操作步驟】（ 1）動物及手術(shù)：大鼠，200250g。ip戊巴比妥鈉50mg/kg，腹腔U型剪開，將腹腔內(nèi)臟器移向大鼠左側(cè)，即可見膽管及肝門靜脈；先插入膽管導(dǎo)管，并固定；然后在門靜脈近肝端與幽門靜脈分支之間穿入一手術(shù)絲線，打一活套，然后插入門靜脈插管，迅速固定，立即開始灌流，打開上、下腔靜脈，沖去肝內(nèi)殘血；將肝完整無損地

37、分離出來，置灌流儀中灌流。 雙向灌流需在插入門靜脈插管灌流后，結(jié)扎下腔靜脈，打開胸腔，由上腔靜脈插入另一套管，再分離出整個肝。2）臟器灌流：將肝移到灌流儀的臟器托盤上，先用灌流液沖洗肝內(nèi)殘存血液。調(diào)整灌流速度，檢查流出液速度，保持灌流液能通暢流出。64【注意事項與評價】（1）手術(shù)過程要迅速、仔細，保持肝被膜完整，盡量不要污染肝。整個手術(shù)要求在1015min內(nèi)完成，門靜脈插管時，斷血時間不超過12min。（2）在大鼠離體肝灌流中，各項條件一經(jīng)選定便應(yīng)保持恒定，以維持肝的穩(wěn)定活力。一般灌流溫度為37，灌流液PO2至少45mmHg，灌流速度視不同灌流介質(zhì)而不同。65第6節(jié)大鼠肝細胞原代培養(yǎng)實驗方法

38、【基本原理】大鼠肝細胞分離方法是在肝離體灌流技術(shù)中引進膠原酶，藉膠原酶消化肝細胞間組織而達到分散肝細胞的目的。然后再經(jīng)分離純化而得到所需用的肝細胞或非實質(zhì)細胞，進行原代培養(yǎng)。66【操作步驟】 (1)肝細胞的分散：先用無鈣灌流液作預(yù)灌流，沖去殘血，除去或減少肝細胞間的鈣離子，以減少細胞間的粘著力。然后再用含鈣的膠原酶灌流液灌流，以消化細胞間質(zhì)而分散肝細胞。67 1)動物手術(shù)：大鼠麻醉，背位固定。剝?nèi)ジ共科つw，75酒精消毒腹膜，無菌剪開，內(nèi)臟移至左側(cè)，暴露肝門靜脈和下腔靜脈。離肝入口1-1.5cm處將肝門靜脈以及下腔靜脈與周圍組織分離開，各穿一根手術(shù)棉線，打一活套備用。并經(jīng)下腔靜脈注射0.06肝素

39、鈉生理鹽水溶液0.50.6ml。將靜脈插管沿已分離的肝門靜脈插入，使針頭前端達左右肝靜脈分支交匯處，迅速結(jié)扎棉線，固定門靜脈插管。立即開始灌流。 68 2)預(yù)灌流：經(jīng)無菌過濾，37和混合氣體(9502，5C02)飽和的無鈣灌流液灌流，剪斷下腔靜脈。灌流速度從慢至快，最后保持在4050mlmin。打開胸腔，前腔靜脈管處系一棉線，從右心房處插管至前腔靜脈處，然后扎緊手術(shù)絲線，以防針管脫落。隨之將后腔靜脈處的棉線扎緊，迫使灌注液改由前腔靜脈插管處流出。先作在位灌流數(shù)分鐘，然后邊灌流邊切斷肝與周圍組織的聯(lián)系，將肝移置肝托盤內(nèi)繼續(xù)灌流。不要損傷肝包膜。灌流液約500ml。693)酶灌流：換用37的通人0

40、2的膠原酶灌流液。膠原酶的濃度一般約為0.05左右。pH7.5，含鈣而不含鎂，含有機緩沖劑(如HEPES)。灌流速度仍維持4050mlmin。膠原酶價貴，可設(shè)計循環(huán)灌流裝置以節(jié)省用酶量。如果灌流通暢，則肝顏色均勻。由于肝細胞間質(zhì)被消化，灌流液進入細胞間隙，因而可見到肝逐漸腫脹。可根據(jù)經(jīng)驗，肉眼觀察肝腫脹程度來選擇最佳灌流時間。一般酶灌流約需815min。4)分散肝細胞：取下肝，將之移至盛有適當培養(yǎng)液(DMEM)的平皿中，撕去肝包膜后，輕輕振搖肝，肝細胞即可散落于培養(yǎng)液中而成肝細胞懸液。70 (2)肝細胞的純化 1)肝細胞的純化：在錐形瓶肝細胞懸液37振蕩培養(yǎng)15min。細胞碎片、庫普弗細胞等則

41、為由損傷細胞排出的粘性物質(zhì)粘結(jié)成小塊，可過濾時除去；完整的肝實質(zhì)細胞則從外形不規(guī)則漸變?yōu)閳A形，因而更加分散，也更易于通過濾網(wǎng)。 振蕩培養(yǎng)結(jié)束后立即將錐瓶置冰水中冷卻，用雙層尼龍網(wǎng)(200目)過濾。濾液4C。200rmin離心3-5min，棄-上清，同上離心三次，培養(yǎng)液重懸，得到絕大部分為肝細胞懸液。71 (4)肝細胞的培養(yǎng)：作短時間培養(yǎng)的實驗可將適當稀釋的肝細胞于合適的小試管內(nèi)作振蕩培養(yǎng)。 如需作較長時培養(yǎng)，則要選用大小合適的培養(yǎng)皿加入適量的肝細胞，于C02培養(yǎng)箱內(nèi)(5%C02與95空氣)進行單層細胞培養(yǎng)。如采用經(jīng)過處理的塑料培養(yǎng)皿，則約經(jīng)1.5-2h培養(yǎng)細胞即可貼壁；如采用未經(jīng)處理的玻璃培養(yǎng)

42、皿，則需經(jīng)8h左右肝細胞方能完全貼壁。72【注意事項】(1) 灌流過程中如果肝顏色不均勻或出現(xiàn)花斑，即表明灌流不暢。灌流不暢時不僅細胞問質(zhì)消化不夠，減少分散的細胞產(chǎn)量，而且分散所得細胞的活率和功能也差。缺氧/壓力增高都會使肝細胞損傷。灌流不暢的可能原因有：肝位置不佳致血管扭曲；插管插入過深，或插管尖頭的斜面過長，堵塞了門脈血管的分支；灌流液中存在小顆粒物質(zhì)或微小氣泡而堵塞小血管；麻醉過深或手術(shù)時間過長，或麻醉前動物過度緊張、應(yīng)激反應(yīng)等兒茶酚胺類分泌過多等因素使血管收縮。(2)灌流液必須含有足夠的緩沖劑系統(tǒng)，以保證酶灌流過程中pH維持在最適范圍。73 第7節(jié) 大鼠肝星狀細胞及 庫普弗細胞原代培養(yǎng)實驗方法 【基本原理】大鼠肝星狀細胞(HSC)及庫普弗細胞(KC)分離方法是在肝離體灌流技術(shù)中，利用鏈霉蛋白酶裂解肝細胞、膠原酶解除肝非實質(zhì)細胞間的連接、DNA酶降解DNA，形成較為完全的單細胞懸液，根據(jù)HSC和KC密度的不同，采用密度梯度離心的方法分離出HSC和