熒光定量PCR資料

1、一、 樣品RNA的抽提1.勻漿 將-80凍結(jié)的RNA提取樣品迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，向研缽中加入與樣品勻漿量匹配的適量的RNAiso Plus，并將組織樣粉末覆蓋。2.抽提 室溫放置5min，使核蛋白復(fù)合物完全溶解后轉(zhuǎn)移至1.5mL無(wú)酶離心管中，室溫靜置5min，12000r/min，4離心15min；小心吸取上清液移入新離心管，加上清液的1/5體積量的氯仿，靜置10min；12000 r/min，4離心10min。（此時(shí)分三層：無(wú)色上清液、白色蛋白層、帶顏色的下層有機(jī)相）；3.RNA沉淀 吸取上清液移至新離心管，切勿吸入中間蛋白層，向

2、上清液中加入與上清液等量體積的異丙醇。顛倒混勻后室溫靜置10min，12000r/min，4離心5min（此時(shí)底部會(huì)出現(xiàn)沉淀）；4.RNA洗滌 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入1 ml的75%乙醇（用DEPC水或無(wú)酶無(wú)菌水配制，超凈臺(tái)中配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?下12000r/min離心5分鐘。5.RNA溶解 吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。加入無(wú)RNA酶的水20-40L用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80待用。二、 RNA濃度和質(zhì)量的測(cè)定1. 1%-1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性：將從肌肉中提取的總RNA

3、吸取5，加入1L 6 X Loading Buffer,混勻，點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，120V電壓電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。2. 核酸蛋白分析儀檢測(cè)OD；吸取2L的RNA檢測(cè)OD260/OD280檢測(cè)含量與純度，A260A280在1.9-2.1之間，說(shuō)明提取的總質(zhì)量很好，記錄稀釋后RNA的Conc值（濃度）。三、 實(shí)時(shí)定量引物實(shí)時(shí)定量引物根據(jù)NCBI公布的基因序列，依據(jù)實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)原則，使用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)，管家基因引物引用參考文獻(xiàn)所列，引物由上海生工有限公司合成。四、 反轉(zhuǎn)錄 寶生物（大連）工程有限公司TaKaRa Prime Script TMRT reagent K

4、it with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系及步驟如下；1. 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈采用SYBR Green qPCR法反轉(zhuǎn)錄，體系如表。試劑添加量（L）步驟的反應(yīng)液10.0Prime Script RT Enzyme Mix1.0RT Primer Mix*41.05 X Prime Script Buffer（for Real Time）4.0RNase Free d H2O4.0Total20 按表成分在冰上配制反應(yīng)液。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix，然后再分裝10到每個(gè)PCR反應(yīng)

5、管中。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件；3715min；85sec；424。經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA濃度為50ng/L，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于冰箱中保存。2. 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增本試驗(yàn)應(yīng)用CFX96TMReal-Time PCR Detection System擴(kuò)増儀的操作方法。使用TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTM（TLi RNaseH Plus）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。（1）實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系以上一步反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，按表組份配制反應(yīng)液（反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行）。以GAPDH基因作為參照基因，對(duì)樣品中MyHC、MyHC、MyHC、MyHC基因在RNA水平進(jìn)

6、行相對(duì)定量分析。目的基因與管家基因分別做-個(gè)平行樣，每個(gè)歲齡的羊做10只平行，次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系如表：（2）將配置好的反應(yīng)體系裝入12排八聯(lián)管中，放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)増。設(shè)置反應(yīng)條件為：（3）經(jīng)擴(kuò)増反應(yīng)后，將產(chǎn)物于冰箱中保存。3. PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢驗(yàn)吸取2L的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入6 X Loading Buffer混勻，點(diǎn)入1.0%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，120V電壓電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量。五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析方法：本試驗(yàn)采用-法，計(jì)算公式：（）相對(duì)表達(dá)量（fold change）-t；（）（目的基因-t內(nèi)參基因）處理組-（t目的基因-t內(nèi)參基因

7、）未處理組。1. 紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。（1）濃度測(cè)定A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260稀釋倍數(shù) 40 g/ml。具體計(jì)算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5 l，1:100稀釋至495 l的TE中，測(cè)得A260= 0.21 RNA 濃度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l取5 ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 l，剩余RN

8、A總量為：35 l 0.84 g/l = 29.4 g（2）純度檢測(cè)RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定（1）制膠1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60，10 ml的10 MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)10MOPS電泳緩沖液濃度 成分0.4 M MOPS，pH 7.00.1 M 乙酸鈉0.01 M EDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。（2）準(zhǔn)備RNA樣品取3 gRNA，加3倍體積的甲醛

9、上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 g/ml。加熱至70孵育15分鐘使樣品變性。（3）電泳上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。（4）紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，

10、將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。三、樣品cDNA合成1. 反應(yīng)體系序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2 l2 上游引物 0.2 l3 下游引物 0.2 l4 dNTP 0.1 l5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5 l6 DEPC水 5 l7 RNA模版 2 l8 總體積 10 l輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。2. 混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 l，37水浴60分鐘。3. 取出后立即95干浴3分

11、鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80待用。四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（-actin）實(shí)時(shí)定量PCR1. -actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3 l按10倍稀釋（加水27 l并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。2. 反應(yīng)體系如下：標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10 l2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5 l3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5 l4 dNTP 0.5 l5 Taq酶 1 l6 陽(yáng)性模板DNA 5 l7 ddH2O 32.5 l8 總體積

12、50 l輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。3. 管家基因反應(yīng)體系：序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10 l2 內(nèi)參照上游引物F 0.5 l3 內(nèi)參照下游引物R 0.5 l4 dNTP 0.5 l5 Taq酶 1 l6 待測(cè)樣品cDNA 5 l7 ddH2O 32.5 l8 總體積 50 l輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。3. 制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：932分鐘，然后93 1分鐘，55 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板1. 針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)

13、行PCR反應(yīng)。2. 反應(yīng)體系序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1 10 PCR緩沖液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至總體積為 25 ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個(gè)PCR循環(huán)（94 1分鐘；551分鐘；721分鐘）； 72延伸5分鐘。（3）PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。（4）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物

14、濃度為11010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。六、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR1. 所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。2. 體系配置如下：序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1 ul3 下游引物 1 ul4 dNTP 1 ul5 Taq聚合酶 2 ul6 待測(cè)樣品cDNA 5 ul7 ddH2O 30 ul8 總體積 50 ul輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。（3）將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93 2分鐘預(yù)變性，

15、然后按93 1分鐘，551分鐘，721分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后727分鐘延伸。七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。八、電泳各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2瓊脂糖凝膠電泳，Gold View染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。PCR-SSCP分析的基本程序?yàn)椋菏紫萈CR擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙

16、烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長(zhǎng)短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來(lái)維持。相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含單堿基置換，或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開(kāi)。由此可見(jiàn)，PCR-SSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈

17、凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長(zhǎng)DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來(lái)檢測(cè)基因變異。該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測(cè)、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領(lǐng)域。為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果，現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢(shì)及適用領(lǐng)域。例如，可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)，利用-32P-ATP標(biāo)記引物或直接在PCR反應(yīng)體系中加入-32P-dCTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記

18、物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測(cè)和篩選；后者操作簡(jiǎn)便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，可用于小樣本或大樣本的檢測(cè)和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。一、試劑準(zhǔn)備PCR相關(guān)試劑-32P-dCTP30聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 保存。10過(guò)硫酸銨配制方法：1g 過(guò)硫酸銨，溶于10ml ddH2O中，4 OC保存（可用數(shù)周）。TEMED（N，N，N，N，N

19、-四甲基乙二胺） 5TBE緩沖液：Tris堿54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步驟 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10l，在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分：10buffer 1ldNTPmix 70MDNA模板 100ng引物及Taq DNA酶 依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入-32P-dCTP 0.1l加ddH2O至10l按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自

20、來(lái)水反復(fù)沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，晾干，95乙醇擦拭，自然干燥。用棉簽沾取SigmaCote涂于玻璃的貼膠面上， 510min后再用軟紙擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)放好襯條對(duì)齊，用固定夾夾緊兩塊玻璃，并用玻璃膠帶封邊。 制膠：按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積，一般來(lái)講使用58的凝膠較為合適。輕輕搖勻配制的膠液于真空抽氣（開(kāi)始時(shí)要緩慢）除氣泡，加 35l TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液，將玻璃模具傾斜成60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳

21、，（小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳子時(shí)把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過(guò)程中有回縮，所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去，放入電泳槽，凹型玻璃貼緊電泳緩沖液槽，用大號(hào)固定夾固定住兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入 1TBE電泳緩沖液。小心取出點(diǎn)樣梳，用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理：將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與變性上樣液按1：5的比例加入0.5ml微量離心管中，混勻。樣品上膠前應(yīng)98變性10min，立即冰浴驟冷。取約35l變性樣品（根據(jù)點(diǎn)樣孔的大小決定上樣量），以微

22、量加樣器上樣，（上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品，而且速度要快，時(shí)間長(zhǎng)了樣品易于擴(kuò)散）。 電泳：電泳槽接上電極（上槽接負(fù)極，下槽接正極）開(kāi)啟電源，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l5Vcm電泳。 剝膠：電泳結(jié)束后，倒棄電泳緩沖液，取下電泳膠玻璃，用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開(kāi)玻璃，凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上，切去凝膠左上角，作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙，嚴(yán)密覆蓋于凝膠上，順一個(gè)方向?qū)⒛z緩慢取下，用保鮮膜蓋于膠面并包好，避免膜和膠之間產(chǎn)生氣泡或皺折，將凝膠固定在X線片夾中。放射自顯影：在暗室中將X線片貼于膠面，蓋嚴(yán)片夾，用黑布將X線片

23、夾包裹，置-70OC放射自顯影。曝光時(shí)間根據(jù)同位素的強(qiáng)度而定，約 24h10d。 沖洗膠片從-70oC取出X線片夾，在暗室內(nèi)迅速取出X線片，立即顯影，以免使X線片上出現(xiàn)過(guò)多的冷凝水。（如果想再得到一張放射自顯影影像，可立即在片夾中裝一張新X線片并盡快放回到一70oC繼續(xù)顯影。如果來(lái)不及再加入新片即已出現(xiàn)冷凝水則應(yīng)使樣品凝膠和X線片夾都恢復(fù)到室溫，并擦去冷凝水后再裝入新的X線片）。依次按以下程序操作進(jìn)行顯影：X線片顯影液顯影 1-5min水洗 lmin定影液定影 5min流動(dòng)水沖洗 15min所有使用液的溫度應(yīng)為1820OC為宜。三、注意事項(xiàng) 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，檢

24、測(cè)的敏感性越高。對(duì)于200bp的片段，SSCP可發(fā)現(xiàn)其中70的變異；對(duì)于300bP左右的片段則只能發(fā)現(xiàn)其中50的變異；而500bp的片段，則僅能檢出103O的變異，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更適于SSCP分析。對(duì)于大于400bp的PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理，可以用限制性酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生小于400bP的DNA片段，再進(jìn)行SSCP分析。 游離引物: 游離引物可能同 PCR產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率，即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此，應(yīng)盡可能除去游離引物?？梢圆捎貌粚?duì)稱引物擴(kuò)增方法，盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過(guò)柱或磁性球方法純化PCR產(chǎn)物。或者是稀釋PCR產(chǎn)物，減少游離引物的干擾。 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑，如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亞砜（DMSO）或蔗糖等有助于