DNA指紋技術(shù)及其應(yīng)用

1、DNA 指紋技術(shù)及其應(yīng)用周 珊珊(浙大環(huán)科所，杭州 310029)摘要 綜合比較、分析了目前常DNA指紋技術(shù)，如RFLP、VNRT、RARP、AFLP、STS(SSR、CAPS、 SCAR)、RFLP、SSCP、SNP等的原理、特點(diǎn)和適用范圍，簡(jiǎn)要介紹了 DNA指紋技術(shù)的研究發(fā) 現(xiàn)狀以及發(fā)展前景。關(guān)鍵詞DNA指紋技術(shù)；分子雜交；PCR技術(shù)；DNA芯片技術(shù)前言DNA指紋圖譜是一種在單一實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)出大量DNA位點(diǎn)差異性的分子生物 學(xué)技術(shù)。1985年，Jeffreys及其合作者分析了人的肌紅蛋白基因，從中獲得 了多位點(diǎn)的小衛(wèi)星探針。它可同時(shí)與眾多的DNA限制性酶切電泳圖譜雜交，可得 到具多條帶的復(fù)

2、雜圖譜。這種表現(xiàn)出高度的種屬及個(gè)體特異性的雜交圖譜即稱為 DNA指紋圖譜(DNA fingerprint)。隨著各種高水平探針如報(bào)衛(wèi)星探針、寡聚核 苷酸探針的相繼問世，成為當(dāng)今最先進(jìn)的分子水平上的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。指紋圖譜 具有高度的變異性及多位點(diǎn)性，充分體現(xiàn)了物種的遺傳多態(tài)性，使其在動(dòng)植物科 學(xué)研究、遺傳疾病的診斷、基因圖譜的繪制，遺傳標(biāo)記及法醫(yī)學(xué)等方面得到廣泛 應(yīng)用。本文將對(duì)幾類主要的DNA指紋技術(shù)原理及特點(diǎn)做簡(jiǎn)要敘述，并進(jìn)一步闡述 其發(fā)展前景。1. DNA指紋技術(shù)原理及特點(diǎn)基于分子雜交技術(shù)的 DNA 指紋技術(shù)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Pol

3、ymorphism, RFLP) 某些DNA序列的差異可通過限制性酶切片段長(zhǎng)度的改變反映出來，此即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。1980年Botstein等首先提出利用RFLP作為標(biāo)記構(gòu) 建遺傳圖圖譜。其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi) 切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度的酶切片段。RFLP的等位基因具有共顯性特點(diǎn)。RFLP標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量不受限制，通?？蓹z 測(cè)的基因座位數(shù)為14個(gè)。RFLP結(jié)合基因探針分析的最大優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生的帶型 清楚明確。這是因?yàn)橄喈?dāng)大量的DNA被切割，電泳和染色后的DNA片段易于顯示 出來。相反，PCR產(chǎn)生的指紋(如AP-PCR或ERIC PC

4、R產(chǎn)生的指紋)很難以再現(xiàn) 并可能“模糊的”或“假的”帶，使其難以解釋。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是 克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，檢測(cè)周 期長(zhǎng)，成本費(fèi)用也很高4。數(shù)目變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(Variable Number of Tandem Repeats, VNRT)VNTR首先由Wyman和White5在篩選人DNA基因文庫時(shí)得到，當(dāng)時(shí)他們稱之 為：高變重復(fù)區(qū)。VNTR是繼RFLP之后的一類具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，這類 基因順序多位于基因非編碼區(qū)，以及染色體的近端粒區(qū) 6,7，目前對(duì)其確切功能 不明。按非編碼的重復(fù)序列在DNA分子上分布的方式，可分為散

5、布重復(fù)序列和串 聯(lián)重復(fù)序列，而串聯(lián)重復(fù)序列又根據(jù)重復(fù)單位大小不同可分為：(1)小衛(wèi)星序 列，重復(fù)單元核心序列含有670bp，中間無間隔，總長(zhǎng)度一般小于lkbp； (2) 微衛(wèi)星序列，或簡(jiǎn)稱重復(fù)序列(Simple Sepuence Repeats,SSR)重復(fù)單元含有 16bp8。每個(gè)特定位點(diǎn)的VNTR由兩部分組成：中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)，核 心區(qū)含有至少一個(gè)以上稱為“重復(fù)”的短序列，一般假設(shè)該重復(fù)單位的堿基對(duì)數(shù)目 幾乎不變，而串聯(lián)在一起的重復(fù)單位數(shù)日是隨機(jī)改變的。如果用一種不切重復(fù)單 位的限制酶把DNA分子切割成限制性片段，該限制性片段中位于核心區(qū)外圍的即 是側(cè)翼區(qū)。我們可根據(jù)重復(fù)單位或側(cè)

6、翼區(qū)大小、序列的不同及拷貝數(shù)的不同來進(jìn) 行基因組多態(tài)性的分析。許多酶都能在其側(cè)翼區(qū)找到切點(diǎn)，并且等位基因多，雜合子比例較高，加上 VNTR位點(diǎn)等位基因呈孟德爾經(jīng)典遺傳，放作為良好的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，它比RFLP 更具有應(yīng)用價(jià)值。2.2基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜技術(shù)2.2.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (Random Amplified Polymorphism DNA RAPD)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)是1990年首次由William等9提出的用于監(jiān) 測(cè)DNA多態(tài)性的新型的PCR技術(shù)。它是利用單個(gè)的、任意序列的寡聚核苷酸(一 般選用910個(gè)13)作引物，隨機(jī)地與靶序列完全或部分配對(duì)，以

7、擴(kuò)增出特異的 DAN產(chǎn)物。由于引物的設(shè)計(jì)不需要特異的核苷酸序列信息，避免了 PCR特異性引 物設(shè)計(jì)上的困難。另外，多個(gè)引物對(duì)同一標(biāo)本DNA的全方位掃描可使檢測(cè)區(qū)域擴(kuò) 展以至整個(gè)基因組，從而得到更廣泛的DNA多態(tài)信息，甚至能監(jiān)測(cè)出單個(gè)堿基的 變化10。RAPD 分析因其引物序列的任意性及其低退火溫度決定了其反應(yīng)的非嚴(yán)格性，它比一般PCR更易受到很多因素的影響，如DNA的制備，引物、模板濃度的 比率，離子濃度，DNA聚合酶，PCR循環(huán)多數(shù)，變性、復(fù)性溫度及時(shí)間，溫度變 換速率，PCR儀等等。這些因素改變，擴(kuò)增出的圖譜便不同。這些影響因素不具 有遺傳性，而是由人為因素造成的，它將影響對(duì)基因組多態(tài)性的

8、正確評(píng)價(jià)，影響 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。目前優(yōu)化RAPD反應(yīng)的條件，將真實(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物與這些人為因素 的影響區(qū)別開來，仍RAPD分析的研究重點(diǎn)11,。2.2.2序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS)特定序列位點(diǎn)(sequence-tagged site)是對(duì)由其特定引物序列所界定的一 類標(biāo)記的統(tǒng)稱。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是它產(chǎn)生的信息非?？煽浚幌?RAPD、AFLP和利用隨機(jī)探針產(chǎn)生的RFLP存在某種模糊性(如難以鑒別片段的來 源)。這類分子標(biāo)記主要包括以下幾種分子標(biāo)記。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)SSR(simple sequuence repeats)由l6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)短 片段，如(

9、GT)n，(GATA)n等組成。人們可根據(jù)其兩側(cè)獨(dú)的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，再用瓊脂糖凝膠或變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分離產(chǎn)物，檢測(cè)多態(tài)性SSR 作為分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，穩(wěn)定性高，檢測(cè)獲得的多態(tài)性位點(diǎn)多， 遺傳變異信息量大。Genbank、EMBL、DDBJ等DNA序列數(shù)據(jù)庫的建立使SSR技術(shù) 的應(yīng)用更為方便。針對(duì)高度密集CA微衛(wèi)星簡(jiǎn)單重復(fù)序列設(shè)計(jì)中由于重復(fù)CA引物對(duì)高度重復(fù)靶 位點(diǎn)易形成擴(kuò)增條帶涂布現(xiàn)象,Zietkiewicz等提出了錨定SSR(ASSR，或ISSR) 的新策略。即在SSR的3端或5端錨定14個(gè)簡(jiǎn)并堿基，避免了 SSR在基因組 上的滑動(dòng)，大大提高了聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

10、應(yīng)擴(kuò)增的專一性。在所在兩端的引物中，可 以一個(gè)為錨定引物，另一個(gè)為隨機(jī)引物8。酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences， CAPS)CAPS技術(shù)又稱為PCR-RFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方 法。其基本步驟是：根據(jù)已有的 DNA 數(shù)據(jù)資源設(shè)計(jì)出一套特異引物，然后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分 離酶切片斷，染色并進(jìn)行RFLP分析。與RFLP技術(shù)一樣，CAPS技術(shù)檢測(cè)的多態(tài) 性其實(shí)是酶切片段大小的差異14。CAPS 是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是 RFLP 分析中模轉(zhuǎn)

11、印這一步驟，又 能保持 RFLP 分析的精確性。序列特異擴(kuò)增區(qū)域( Sequence-characterized amplified regions ， SCAR)SCAR標(biāo)記是在PAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的15。其基本步驟是：先作PAPD 分析，然后把目標(biāo)RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進(jìn)行克隆和測(cè)序， 根據(jù)原RAPD片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物(一般比RAPD引物長(zhǎng)，通常1824 個(gè)堿基)，再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，這樣就可把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒 定出來。SCAR比RAPD和其它利用隨機(jī)引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更 好，因?yàn)樗懈叩目芍貜?fù)性(原因是使用

12、的引物長(zhǎng))，標(biāo)記是共顯性遺傳的8。單引物擴(kuò)增反應(yīng)(Single Print Amplification Reaction，SPAR)SPAR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似的是也只用一個(gè)引物，但SPAR分析中所用的引 物不是隨機(jī)的，而是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，例如可能的序列是(TA)或(CGA)。10 6 擴(kuò)增的是SSR之間的DNA序列(即散布重復(fù)序列中的間隔序列部分)16。又稱為 MP-PCR(microsatellite-primed PCR)17。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Leng th Polymorphism， AFLP)AFLP是RFLP與RAPD相結(jié)合的一種

13、分子標(biāo)記技術(shù)，既具有RFLP標(biāo)記的專 一性、可靠性，又具有RAPD標(biāo)記的隨機(jī)性、方便性，因此被稱為“最有力的分 子標(biāo)記”或“下一代分子標(biāo)記”18。由于該標(biāo)記是通過選用不同的內(nèi)切酶達(dá)到選 擇性擴(kuò)增的目的，因此又被稱作選擇性限制片段擴(kuò)增標(biāo)記(Selective restriction fragment amplification，SRFA)。它將基因組DNA用成對(duì)的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切 位點(diǎn)互補(bǔ))連接起來，并通過5端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量DNA 片段從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。雙酶切產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度一般小于 500bp,在AFLP反應(yīng)中可被優(yōu)先擴(kuò)增，擴(kuò)

14、增產(chǎn)物可被很好地分離，因此一般多采 用稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶與多切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶相搭配使用的雙酶切。擴(kuò)增產(chǎn)物的多少主要取決于引物3末端選擇性堿基的數(shù)目及其核苷酸組成。 選擇性堿基數(shù)一般不超過3個(gè)，當(dāng)選擇性堿基數(shù)增加到4個(gè)時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn) 了原圖譜中未出現(xiàn)的新帶型，說明此時(shí)的錯(cuò)配頻率已超出了允許限度，有“假帶” 現(xiàn)象產(chǎn)生20。2.2.3 DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single St rand Conforma tion Polymorphism, SSCP）一級(jí)結(jié)構(gòu)不同亦即核苷酸序列有差異的 DNA 片段之間由于存在細(xì)微的空間 結(jié)構(gòu)上的差別而呈現(xiàn)出不同的構(gòu)象形態(tài)。在非變性的聚丙烯酰胺凝膠中單鏈DN

15、A 的泳動(dòng)速率不僅取決于DNA片段的長(zhǎng)度而且決定于其序列。PCRSSCP分析法正 是利用這一原理對(duì)序列組成不同的核苷酸片段進(jìn)行區(qū)分。也就是說具有單個(gè)堿基 差異的不同DNA鏈，即使它們的片段長(zhǎng)度相等也可以在非變性聚丙烯酰胺凝膠上 以遷移率改變（mobility shift）的方式區(qū)分開來2122。PCRSSCP法與傳統(tǒng)的檢測(cè)基因突變的方法相比的有獨(dú)到之處。第一，它可 以檢測(cè)任何（包括已知的和未知的） DNA 位點(diǎn)上的多態(tài)性和突變，且檢測(cè)敏感性 高。第二，無需事先知道待檢測(cè)DNA片段的序列，只要能夠根據(jù)已有的資料設(shè)計(jì) PCR引物即可進(jìn)行PCRSSCP分析。第三，它省去了酶切消化以及核酸雜交等復(fù) 雜

16、的實(shí)驗(yàn)步驟23，操作簡(jiǎn)便，整個(gè)過程可在一至兩天內(nèi)完成，適合于同時(shí)對(duì)大量 樣品進(jìn)行篩選。當(dāng)然這一技術(shù)也有自身的缺陷。首先，它不能對(duì)DNA序列變異進(jìn)行精確的定 位，而只能對(duì)其進(jìn)行初篩，其次，雖然從理論上講PCRSSCP法可以檢測(cè)任何位 點(diǎn)上的堿基變異，但在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)遇到相當(dāng)比例的假陰性結(jié)果。 2.3基于DNA芯片技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)1994 年，單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，簡(jiǎn)稱 SNP） 這個(gè)術(shù)語第一次出現(xiàn)在人類分子遺傳雜志上，隨后 Lander24 第一次正式提出 SNPs為新一代分子標(biāo)記。SNPs是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換

17、（C與T互換，在 其互補(bǔ)鏈上則為G與A互換）或顛換（C與A, G與T, G與G, A與T互換）等變異 所引起的DNA序列多態(tài)性。在人類群體中，SNPs的頻率約占1%甚至更高。據(jù)估 計(jì)，一個(gè)人應(yīng)至少攜帶300萬個(gè)SNPs，全部人群的SNPs總數(shù)可達(dá)千萬（Brooks， 1999）。通常所說的SNP都是二等位性的，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3, 其他幾種SNP在相似的水平上，因?yàn)镃pG二核苷酸的胞嘧啶是人類基因組中最易 發(fā)生突變的位點(diǎn)。根據(jù) SNPs 在基因組分布的位置可分為基因編碼區(qū) SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類沏。總的說來，

18、cSNP 比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的 15，但它在遺傳病和 育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響，cSNPs又 可分為兩種：一種是同義cSNPs(Synonymons cSNPs)，即SNP所致編碼序列的改 變并不影響其所翻譯的氨基酸序列；另一種是非同義 cSNPs(nonsynonymons cSNPs)，即指堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改 變，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。 cSNP 中約有一半為非同義 cSNP26。就SNP發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)手段來講，經(jīng)典方法采用PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCRSSCP)分析、RELP

19、、dHPLC和HA等，由于它們必須通過凝膠電脈等進(jìn)行分 析，因此，距快速、高效、自動(dòng)化的目標(biāo)還相差甚遠(yuǎn)。 SNPs 本身的特點(diǎn)使其具 備其他分子標(biāo)記無可比擬的優(yōu)越性，奠定了應(yīng)用DNA微陣列、DNA芯片等高新技 術(shù)來發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)生物基因組之問差異的基礎(chǔ)。若能將所有SNP信息載入DNA芯片, 可制造“基因組掃描儀”，用來掃描各個(gè)體并分析它們?cè)诨蚪M成上的差異27。 最新報(bào)道的微芯片電泳，可快速檢測(cè)臨床樣品SNP。Affymetrix公司最新開發(fā) 了一張人類SNP芯片，該芯片總共包含11500個(gè)人類SNP，每隔lOOkb 個(gè)。該 芯片是測(cè)序芯片，每個(gè)SNP位點(diǎn)的結(jié)果是經(jīng)過四十次測(cè)序驗(yàn)證的，因此其結(jié)果相

20、 當(dāng)可靠。該技術(shù)可以用于功能基因的定位、LOH以及不同人群差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ) 的研究。2. DNA指紋技術(shù)的發(fā)展前景縱觀上述各種分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展歷史，根據(jù)技術(shù)的自身特點(diǎn)，將來的分子 標(biāo)記技術(shù)將主要向以下兩方面發(fā)展29：(1)提高多位點(diǎn)、大規(guī)模檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確 性和重復(fù)性；(2)提高單位點(diǎn)標(biāo)記的易用性和經(jīng)濟(jì)性；二者最終將會(huì)相互緊密的 融合到一起。就當(dāng)前的技術(shù)現(xiàn)狀而言，毫無疑問，建立在DNA變異的基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記已 成為技術(shù)領(lǐng)域的主流。其中，以AFLP為代表的分子標(biāo)記技術(shù)由于有著良好的重 復(fù)性、準(zhǔn)確性以及能夠建立高質(zhì)量、高密度的遺傳連鎖圖譜，已經(jīng)在多位點(diǎn)標(biāo)記 方面替代了 RAPD、DAF等早期的標(biāo)記

21、，對(duì)未知基因組生物的研究發(fā)揮著重要的作 用30。另外，隨著人類基因組計(jì)劃的即將完成、數(shù)十種模式生物基因組序列的測(cè) 定，SNPs在一年間數(shù)量增長(zhǎng)了一千倍31，它將會(huì)在已知基因組序列的研究中得 到迅速的發(fā)展。參考文獻(xiàn)：Jeffereys A J, Grimont F, Grimont P A D, Ribosomal ribonncleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic toolJ. Nature, 1985, 314:67.Bostein Dr, et al. AM.J. Hum .GenetJ. 1980,32:31

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