《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)》05 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

1、RNA干擾實(shí)驗(yàn)一、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法【實(shí) 驗(yàn) 原 理】磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法。磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時表達(dá)，也可整合到靶細(xì)胞的染色體上從而產(chǎn)生不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。該方法可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞。 【儀器、材料和試劑】（一）儀器、用具CO2培養(yǎng)箱、10cm細(xì)胞培養(yǎng)平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml錐形管、燒杯、量筒等。 （二）材料呈指數(shù)生長的真核細(xì)胞BALB/c 3T3CsCl純化的表達(dá)質(zhì)粒DNA（三）試劑1完全培養(yǎng)液

2、 DMEM 90mlFCS 10ml22M CaCl2，過濾除菌，-20保存?zhèn)溆?2HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖 1.0用NaOH調(diào)pH至6.95，過濾除菌后，-20保存?zhèn)溆?。【方法與步驟】1在10cm的培養(yǎng)板上接種1106個BALB/c 3T3細(xì)胞第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染2準(zhǔn)備CaPO4沉淀2.1 準(zhǔn)備兩組試管在A管中加入： 15g質(zhì)粒DNA69l 2M CaCl2 460l重蒸水在B管中加入： 550l 2HEBS 2.2 用巴斯德吸管將A管中的溶液緩慢地逐滴加入在B管中，同時用另一吸管吹打B管溶液，整個過程需

3、緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)12min。 2.3室溫靜置30min，出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養(yǎng)細(xì)胞的10cm平板中，輕輕晃動（此過程需盡快完成）。4. 在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞2-6 hr。5. 除去培養(yǎng)液，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞1-6天（依具體情況而定）。6. 收集細(xì)胞進(jìn)行基因活性的檢測，或分散接種到其他培養(yǎng)皿中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。【注 意 事 項(xiàng)】1在整個轉(zhuǎn)染過程中要保持無菌操作。2在實(shí)驗(yàn)中使用的各種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量。3質(zhì)粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無菌，在無菌水或Tris- EDTA中溶解。4沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)

4、染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物，因?yàn)槌蓤F(tuán)的DNA不能有效地黏附和進(jìn)入細(xì)胞。二、電穿孔和電融合技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)細(xì)胞置于非常高的電場中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運(yùn)用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細(xì)胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動物細(xì)胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細(xì)胞。與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必象顯微鏡那樣使用玻璃針

5、，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對成百萬的細(xì)胞進(jìn)行注射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。第三，因?yàn)殡姶┛资且环N物理方法，較少依賴細(xì)胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。 除了能使細(xì)胞膜具有通透性，讓外界的分子擴(kuò)散入胞液中以外，高強(qiáng)度的電場脈沖也能引起細(xì)胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細(xì)胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實(shí)驗(yàn)室已證明使用電場電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到

6、100倍，最近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來研究細(xì)胞融合時細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動力學(xué)重排。儀器、材料和試劑（一）儀器：脈沖發(fā)生器，樣品池：一個盛細(xì)胞的容器和兩個平行的金屬電極，CO2培養(yǎng)箱，離心機(jī)，顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細(xì)管，離心管等。 （二）材料：（三）試劑：穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）10mmol/L HEPES調(diào)節(jié)pH至7.3融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇2mmol/L HEPES調(diào)節(jié)pH至7.3方法與步驟一懸浮細(xì)胞的電穿孔法：1電穿孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移電

7、穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細(xì)胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉(zhuǎn)移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進(jìn)行，只需把外源DNA換頁所需分子即可。1.1使細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對數(shù)生長中期的細(xì)胞，并用腺酶處理。1.2在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細(xì)胞時，在臺式離心機(jī)上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細(xì)胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細(xì)胞。1.3計數(shù)細(xì)胞，在PM中，濃縮細(xì)胞為大約1千萬細(xì)胞/ml。1.4將DNA加到細(xì)胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細(xì)胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。1.5在電穿孔裝置上設(shè)置輸

8、出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時間常數(shù)，即=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達(dá)到合適的值。 1.6將小池放進(jìn)盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。1.7電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細(xì)胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。1.8在測定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)量前電穿孔細(xì)胞各自培養(yǎng)的時間不同。2檢測電穿孔效率和細(xì)胞存活率2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標(biāo)細(xì)胞的

9、方法如前所述。2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。 2.3 電穿孔后30min，向細(xì)胞懸液中加30l臺盼藍(lán)，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。2.4 在1000rpm下離心3min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于PM中，終體積100l。2.5 將一滴細(xì)胞液（30l）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細(xì)胞，測定攝取熒光標(biāo)記葡聚糖的百分?jǐn)?shù)。2.6 在亮視野鏡片下，死細(xì)胞可因染成藍(lán)色檢測出（攝取了臺盼藍(lán)），測定細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。2.7 在各種電場設(shè)定值下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，畫出攝取葡聚糖率和細(xì)胞存活率對電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對特定細(xì)胞類型電穿孔的最優(yōu)條件。二懸浮生長細(xì)胞

10、的電融合 融合懸浮細(xì)胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進(jìn)行高強(qiáng)度的電場脈沖前后，必須用低幅、高頻電場使細(xì)胞排成一條鏈。1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細(xì)胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細(xì)胞時，在臺式離心機(jī)上1000rpm下離心3分鐘，得到細(xì)胞沉淀，棄去上清液將細(xì)胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。2 將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細(xì)胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。3 啟動介電電泳場，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測細(xì)胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達(dá)到最佳效果。4 讓介電電泳場開約1分鐘后關(guān)掉，立即應(yīng)用融合脈沖，其振幅數(shù)量級為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進(jìn)行融

11、合脈沖后立即再次啟動介電電泳場，常規(guī)讓其開啟約2分鐘。5 關(guān)掉介電電泳場，讓細(xì)胞在樣品池中靜置10分鐘。6 去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細(xì)胞。7 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱一般條件下培養(yǎng)。注意事項(xiàng)1 最優(yōu)組分依使用的特定細(xì)胞種類而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應(yīng)嘗試改變穿孔介質(zhì)。2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，為達(dá)到最高效率，必須收集對數(shù)生長中期的細(xì)胞。1.純化siRNA 在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核

12、苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個步驟不受RNA酶污染非常重要。3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性 通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。 4.避免使用抗生素 抗生素會在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 針對siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。 6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件 對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同