酶的分離純化

1、酶分離純化彭景玉 196747009王建丹 196747011酶的分離純化第1頁一、酶提取與分離純化技術(shù)路線二、細胞破碎三、酶提取四、酶分離方法GoGoGoGo目錄酶的分離純化第2頁一、酶提取、分離純化技術(shù)路線細胞破碎 酶提取酶分離純化 酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞 發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶的分離純化第3頁酶純化過程，約可分為三個階段：(1) 粗蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 均質(zhì)打破細胞 抽出全蛋白，多使用 鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外物質(zhì)。(2) 部分純化 (partially purified): 初步純

2、化，使用各種柱層析法。(3) 均質(zhì)酶 (homogeneous): 目標(biāo)酶深入精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不一樣階段酶的分離純化第4頁二、細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-II D超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型 電動玻璃勻漿機酶的分離純化第5頁機械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法經(jīng)過機械運動產(chǎn)生剪切力，使組織、細胞破碎

3、。經(jīng)過各種物理原因作用，使組織、細胞外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。經(jīng)過各種化學(xué)試劑對細胞膜作用，而使細胞破碎經(jīng)過細胞本身酶系或外加酶制劑催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而到達細胞破碎細胞破碎方法及其原理酶的分離純化第6頁酶提取是指在一定條件下，用適當(dāng)溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中過程。也稱為酶抽提。酶提取時首先應(yīng)依據(jù)酶結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)溶劑。普通說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多非極性基團，則可用有機

4、溶劑提取。 三、酶提取提升溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提升酶分子擴散速度，從而增大提取效果。 為了提升酶提取率并預(yù)防酶變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的分離純化第7頁酶主要提取方法提取方法使用溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大酶酸溶液提取PH26水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性很好酶堿溶液提取PH812水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性很好酶有機溶劑提取可與水混溶有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢靠或含有較多非極性基團酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在

5、低濃度鹽存在條件下，酶溶解度隨鹽濃度升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。 酶的分離純化第8頁四、酶分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go酶的分離純化第9頁1、沉淀分離沉淀分離是經(jīng)過改變一些條件或添加某種物質(zhì)，使酶溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理 鹽析沉淀法利用不一樣蛋白質(zhì)在不一樣鹽濃度條件下溶解度不一樣特征，經(jīng)過在酶液中添加一定濃度中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不一樣兩性電解質(zhì)有不一樣等電點這一特征，經(jīng)過調(diào)整溶液p

6、H值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中溶解度不一樣，經(jīng)過添加一定量某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入一些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定條件使酶液中存在一些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需酶，從而使酶與雜質(zhì)分離酶的分離純化第10頁2、離心分離 離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生離心力，使不一樣大小、不一樣密度物質(zhì)分離技術(shù)過程。 在離心分離時，要依據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)顆粒大小、密度和特征不一樣，選擇適當(dāng)離心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機, 其最大轉(zhuǎn)速在

7、8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物分離。也用于酶結(jié)晶等較大顆粒分離。 高速離心機最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力到達 11041105 g ，在酶分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等分離。為了預(yù)防高速離心過程中,溫度升高而造成酶變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機最大轉(zhuǎn)速達 (2.512)104 r/min，相對離心力能夠高達 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等分離純化；樣品純度檢測；沉

8、降系數(shù)和相對分子質(zhì)量測定等。酶的分離純化第11頁3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不一樣大小、不一樣形狀物質(zhì)分離技術(shù)過程。過濾介質(zhì)各種多樣，慣用有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，能夠依據(jù)需要選取。過濾非膜過濾：采取高分子膜以外物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采取各種高分子膜為過濾介質(zhì) 酶的分離純化第12頁 借助于一定孔徑高分子薄膜，將不一樣大小、不一樣形狀和不一樣特征物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成高分子膜。有時也能夠采取動物膜等。膜分離過程中，薄膜作用是選擇性地讓小于其孔徑物質(zhì)顆?；蚍肿?/p>

9、經(jīng)過，而把大于其孔徑顆粒截留。膜孔徑有各種規(guī)格可供使用時選擇。膜分離加壓膜分離 微濾超濾反滲透電場膜分離 電滲析 離子交換膜電滲析 擴散膜分離 透析酶的分離純化第13頁膜技術(shù) 截留物尺寸nm（分子量） 推進力 分離機理 微濾MF 20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分 超濾UF 120 (10,000-40,000) 壓力差，100kPa 篩分 納濾NF 1 (1001000) 壓力差，100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴散 四種慣用膜分離技術(shù)基本特征 酶的分離純化第14頁4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一個物理分離方法。它是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，

10、使各組分以不一樣程度分布在兩個相中，其中一個相為固定(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不一樣速度移動，從而到達分離。酶的分離純化第15頁層析分離方法 層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不一樣物質(zhì)吸附力不一樣而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中分配系數(shù)不一樣，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上可解離基團（活性基團）形成離子鍵能力不一樣而抵達分離目標(biāo)凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分相對分子質(zhì)量不一樣而抵達物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所含有專一而又可逆親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)等電點特征與離子

11、交換層析特征結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離酶的分離純化第16頁親和層析是利用生物分子與配基之間所含有專一而又可逆親和力，而使生物分子分離純化技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補RNA分子或片段,RNA與互補DNA分子或片段等之間，都是含有專一而又可逆親和力生物分子對。故此,親和層析在酶分離純化中有主要應(yīng)用.酶的分離純化第17頁依據(jù)欲分離組分與配基結(jié)合特征,親和層析能夠分為：共價親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析 酶的分離純化第18頁5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反電極移動過程稱為電泳。電泳方法按其使用支持體不一樣，能夠分為： 紙電泳 薄層電泳 薄膜電泳 凝膠電泳 自由電泳 等電聚焦電泳 酶的分離純化第19頁6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中溶解度不一樣而使其分離技術(shù)。萃取分離中兩相普通為互不相溶兩個液相。有時也可采取其它流體。按照兩相組成不一樣，萃取能夠分為：有機溶劑萃取雙水相萃取超臨界萃