光鏡與電鏡技術(shù)3、緒論

1、上海水產(chǎn)大學(xué)生命學(xué)院周平凡光鏡與電鏡技術(shù)第二部分:電子顯微鏡技術(shù)（電子顯微鏡和電子顯微術(shù)的總稱） 一、概 述：第一章:電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)第一節(jié):幾個(gè)常用的基本概念第二節(jié):透射電子顯微鏡第三節(jié):掃描電子顯微鏡第四節(jié):其他類型的電子顯微鏡第二部分:電鏡技術(shù)第二章:超薄切片技術(shù)第一節(jié):取材第二節(jié):固定和固定劑第三節(jié):脫水第四節(jié):浸透和包埋第五節(jié):超薄切片第二部分:電鏡技術(shù)第三章:電子染色技術(shù)第一節(jié):電子顯微鏡標(biāo)本的正染色第二節(jié):電子顯微鏡標(biāo)本的負(fù)染色第三節(jié):半薄切片染色第二部分:電鏡技術(shù)第四章:掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)第一節(jié):取材和標(biāo)本的預(yù)處理第二節(jié):生物樣品的干燥第三節(jié):生物樣品的導(dǎo)電法第二部

2、分:電鏡技術(shù)電鏡有很高的分辨率-能看到生物樣品的表面和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。 通過多種電子顯微術(shù)的配合-能了解生物樣品的化學(xué)組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的關(guān)系。 電鏡技術(shù)-無論在生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究中、還是在臨床醫(yī)學(xué), 都有著廣闊的發(fā)展前景。一、概 述一、概 述一、電子顯微鏡的概況 透射電鏡的點(diǎn)分辨率達(dá)到了2-3A,晶格分辯率已達(dá)到1A左右,已使人們能用電鏡直接觀察原子象； 除透射電鏡外,發(fā)展了多種電鏡,如掃描電鏡、掃描透射電鏡、分析電鏡等,使我們能對樣品進(jìn)行綜合研究。一、概 述一、概 述（一）透射電鏡 透射電鏡-是利用電子射線穿透樣品后放大而成像的一種電鏡。 主要優(yōu)點(diǎn)-分辨率高,可用來觀察組織和細(xì)胞內(nèi)部的

3、超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌,在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用最為廣泛。 加速電壓-一般透射電鏡（加速電壓小于120KV）,高壓透射電鏡（加速電壓在120KV與500KV之間）,超高壓透射電鏡（加速電壓大于500KV）。一、概 述1、一般透射電鏡：就是最常用的100KV電鏡。 這種電鏡的分辨率高(點(diǎn)3A,晶格1.4A),但穿透本領(lǐng)小,觀察樣品必須很薄,如小于0.1微米的超薄切片、負(fù)染樣品和復(fù)型膜等。 這種電鏡在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已相當(dāng)普及。一、概 述一、概 述一、概 述3、超高壓透射電鏡：已有500KV、1000KV和3000KV的超高壓電鏡。 這種電鏡具有穿透能力強(qiáng)、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及

4、進(jìn)行各種動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn),分辨率也已達(dá)到或超過100KV電鏡的水平。 在超高壓電鏡上附加充氣樣品室,使人們有可能觀察活細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,對生物醫(yī)學(xué)工作者很有吸引力。這種電鏡龐大而且昂貴,遠(yuǎn)非一般實(shí)驗(yàn)室所能裝備。一、概 述 東京大學(xué)工學(xué)院125萬伏超高壓電鏡（JEOLARM1250），該電鏡價(jià)值1000萬美元，有三層樓那么高，是世界上精確度最高的電鏡之一，主要用于原子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的特性研究。 一、概 述 該電鏡的開放管理每天24小時(shí)向“全世界”開放。 盡管是高精度特大型電鏡，他們?nèi)匀粚?shí)行用戶經(jīng)培訓(xùn)合格后自行上機(jī)的開放模式。 原則上，電鏡實(shí)行測試收費(fèi)管理，但他們電鏡開放的重點(diǎn)是從事高水平的測試

5、服務(wù)與科學(xué)研究。 一、概 述 如果用戶的樣品不需要在這樣高水平的電鏡上測試，即便是付費(fèi)，他們也不予測試，因?yàn)檫@等于是浪費(fèi)了高水平的資源。相反，如果用戶提出的樣品或課題有很高的學(xué)術(shù)、科學(xué)技術(shù)價(jià)值，即便資費(fèi)不夠，他們也會(huì)主動(dòng)接受。一、概 述（二）掃描電鏡 掃描電鏡是利用電子射線轟擊樣品表面,引起二次電子等信號(hào)的發(fā)射,經(jīng)檢測裝置接收后成像的一種電鏡。特點(diǎn)是景深長,所獲得的圖象立體感強(qiáng),可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。 在生物醫(yī)學(xué)中,采用不同的樣品制備技術(shù)可觀察不同的結(jié)構(gòu),如用臨界點(diǎn)干燥方法可觀察樣品的表面形貌； 用冷凍割裂方法可觀察樣品割裂面的結(jié)構(gòu),用鑄型方法可觀察管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。一、概 述一

6、、概 述1、一般掃描電鏡 目前一般商品掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍,分辯率為60A左右,若采用六棚化鑭電子槍,分辨率可提高到40-50A。 這種電鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也已相當(dāng)普及。一、概 述一、概 述一、概 述（四）掃描透射電鏡 掃描電鏡中電子射線作用于樣品后,其中一部分電子可透過樣品成為透射電子,將透過樣品的透射電子和散射電子用檢測器接收成像,即成為掃描透射電鏡。 這種電鏡一般用場發(fā)射電子槍,兼有透射電鏡、掃描電鏡和分析電鏡的特點(diǎn),能觀察較厚的樣品,分辨本領(lǐng)和成象質(zhì)量都很好,是近年來電鏡技術(shù)的最大改進(jìn)之一。一、概 述二、電子顯微術(shù)的概況 電鏡具有很高的分辨本領(lǐng),能觀察極微小的結(jié)構(gòu)。但是電鏡不能直

7、接觀察天然狀態(tài)下的生物標(biāo)本,必須通過各種技術(shù)將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡生物樣品,才能放入電鏡進(jìn)行觀察,這些電鏡樣品制備技術(shù)稱為電子顯微術(shù)。 電鏡能在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用,在很大程度上是由于電子顯微術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展。電子顯微術(shù)種類很多,這里僅介紹幾種常用的技術(shù)。一、概 述1、超薄切片技術(shù) 由于電子射線穿透本領(lǐng)很差,對厚于0.1微米的切片就很難透過。因此,必須把生物標(biāo)本切得很薄才能在透射電鏡下觀察。 超薄切片技術(shù)就是通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟,將生物標(biāo)本切成薄于0.1微米超薄切片的樣品制備技術(shù),用于生物組織的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)研究。 超薄切片技術(shù)是所有電鏡生物樣品制備技術(shù)中最常用、最基本的一種

8、技術(shù)。（一）與透射電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)2、負(fù)染色技術(shù) 利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鴿酸納、醋酸鈾等）將生物標(biāo)本包圍起來,增強(qiáng)背景散射電子的能力以提高反差,在黑暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu),稱負(fù)染色技術(shù)。 這一技術(shù)操作簡便,主要用于顆粒狀標(biāo)本（如細(xì)菌、病毒、分離細(xì)胞器等）的研究。（一）與透射電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)4、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 利用各種細(xì)胞化學(xué)反應(yīng),在超微結(jié)構(gòu)水平上研究細(xì)胞成分的分布和變化的方法稱電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 這一技術(shù)把細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與其化學(xué)組成有機(jī)地聯(lián)系起來,目前主要用于研究細(xì)胞內(nèi)各種大分子物質(zhì)和酶的定位等。（一）與透射電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)5、免疫電鏡技術(shù) 這是一種使抗原在超微

9、結(jié)構(gòu)水平上定位的技術(shù),應(yīng)用與抗原相應(yīng)的標(biāo)記抗體,在電鏡下觀察標(biāo)記物的位置,從而定位相應(yīng)抗原。 這一技術(shù)有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。（一）與透射電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)1、表面觀察樣品制備技術(shù) 掃描電鏡適合于研究生物樣品的表面特征,樣品制備包括觀察面暴露、固定、干燥和導(dǎo)電等步驟,使表面特征充分暴露而不變形。 這一技術(shù)是掃描電鏡樣品制備的常規(guī)技術(shù),主要用于組織、細(xì)胞、寄生蟲等表面形貌的研究。（二）與掃描電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)2、生物標(biāo)本割裂技術(shù) 將生物標(biāo)本放在特殊包埋劑中經(jīng)冷凍或其他方法國化,然后把固化的標(biāo)本割裂,暴露組織和細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu),再經(jīng)干燥和導(dǎo)電后在掃描電鏡下觀察。 這一技術(shù)使掃描電鏡能觀察生物

10、標(biāo)本的內(nèi)部結(jié)構(gòu),目前最常用的是冷凍割裂技術(shù)。（二）與掃描電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù)（一）在細(xì)胞和分子生物學(xué)方面的應(yīng)用 電鏡技術(shù)有力地推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,使許多在光學(xué)顯微鏡下長期不能解決的問題找到了答案。 由于電鏡具有很高的分辯率,使人們對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)不斷深入,從光學(xué)顯微鏡的顯微結(jié)構(gòu)水平提高到超微結(jié)構(gòu)水平。三、電鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 對光鏡下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器如線粒體、中心體等的結(jié)構(gòu)和功能,在電鏡下有了新的和更深入的了解； 對光鏡下爭論不休的細(xì)胞器如高爾基體,在電鏡下得到了證實(shí)并作了深入的研究； 在電鏡下發(fā)現(xiàn)了很多新的細(xì)胞器和結(jié)構(gòu),如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微體、微管、微絲等；電鏡技術(shù)還對細(xì)胞的膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨

11、架和細(xì)胞聯(lián)結(jié)的研究起著重要作用。 采用多種電子顯微術(shù)相結(jié)合,使人們能夠?qū)?xì)胞各部分的結(jié)構(gòu)、代謝和功能聯(lián)系起來進(jìn)行動(dòng)態(tài)的研究,從而極大地豐富了細(xì)胞生物學(xué)的內(nèi)容。三、電鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（二）在解剖學(xué)中的應(yīng)用 對人體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)是醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ),而這一種認(rèn)識(shí)是隨著技術(shù)的發(fā)展而不斷深入的。 光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)使解剖學(xué)在大體解剖的基礎(chǔ)上發(fā)展了顯微解剖學(xué)（組織學(xué)）, 電子顯微鏡的出現(xiàn)則進(jìn)一步發(fā)展了超微解剖學(xué), 使人們對人體的認(rèn)識(shí)達(dá)到了超微結(jié)構(gòu)水平。三、電鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（三）在微生物學(xué)中的應(yīng)用 電鏡技術(shù)在微生物學(xué)中的應(yīng)用主要包括兩個(gè)方面： 對光學(xué)顯微鏡下看得見的原蟲、真菌、細(xì)菌等作進(jìn)一步的超微結(jié)構(gòu)研究； 對病毒的研究。現(xiàn)以病毒研究為