影響免疫組化染色的因素及對策優(yōu)質(zhì)課件

1、影響免疫組化染色的因素及對策影響免疫組化染色的因素及對策良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。 良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免在操作中應(yīng)注重細節(jié)，避免隨意性，嚴格按照技術(shù)流程規(guī)范化操作，一個小的細節(jié)的疏忽或隨意性操作，都可能會對免疫組化染色造成明顯的影響。2、在實際工作中，就可操作性而言，10%的緩沖福爾馬林是兼顧保存組織

2、形態(tài)和抗原性通行的、被廣泛接受的選擇。3、適度、適時的固定。免疫組化染色的質(zhì)量控制5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響6、顯色劑、復(fù)染劑的影響未及時固定的乳腺癌組織ER表達胞漿著色1、建立嚴格的組織脫水試劑規(guī)范化更換制度，保證組織處理質(zhì)量。2、切片厚度一般34m，厚薄均勻、平整，無刀痕、折疊，采用高質(zhì)量防脫載玻片。蘇木素復(fù)染過深過淺都會造成對比不清晰，不利于觀察評價?？贵w覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)抗原修復(fù)環(huán)節(jié)在免疫組化染色中是極為重要的環(huán)節(jié)?？贵w覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)抗原修復(fù)的恰當(dāng)與否，直接關(guān)系到免疫組織化學(xué)染色的成敗，進一步影響最后結(jié)果的正確判讀。蘇木素復(fù)染過深過淺都會造成對比不清晰，不利于

3、觀察評價。過度的固定會造成抗原決定簇的封閉和抗原的丟失?？乖迯?fù)環(huán)節(jié)在免疫組化染色中是極為重要的環(huán)節(jié)。一、影響免疫組化染色質(zhì)量的因素1、標(biāo)本的固定 手術(shù)標(biāo)本的及時固定是保證免疫組化染色質(zhì)量的關(guān)鍵。未能及時固定的組織，會造成細胞的變性和自溶，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞和抗原物質(zhì)的彌散，在免疫組化染色上表現(xiàn)為抗原定位的變化和背景染色的增高。 過度的固定會造成抗原決定簇的封閉和抗原的丟失。在操作中應(yīng)注重細節(jié)，避免隨意性，嚴格按照技術(shù)流程規(guī)范化操作，同一病例的ER表達情況ERER固定不及時固定二周后取材固定8小時后取材同一病例的ER表達情況ERER固定不及時固定二周后取材固定8未及時固定的乳腺癌組織ER表達胞漿著

4、色未及時固定的乳腺癌組織ER表達胞漿著色影響免疫組化染色質(zhì)量的因素2、切片質(zhì)量的影響 切片太厚、皺褶，刀痕，敷貼不牢固，以及脫蠟不徹底，均會影響免疫組化的染色質(zhì)量，易出現(xiàn)非特異性染色和染色不均勻。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素2、切片質(zhì)量的影響影響免疫組化染色質(zhì)量的因素3、抗原修復(fù)環(huán)節(jié)的影響 抗原修復(fù)環(huán)節(jié)在免疫組化染色中是極為重要的環(huán)節(jié)。不同的修復(fù)時間、不同的修復(fù)方法、不同的抗原修復(fù)液，最終的結(jié)果會有差異。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素3、抗原修復(fù)環(huán)節(jié)的影響 同一蠟塊不同修復(fù)方式的結(jié)果ERHer-2(2+)Her-2(1+)微波修復(fù)水浴修復(fù) 同一蠟塊不同修復(fù)方式的結(jié)果ERHer-2(2+)H 同一蠟塊

5、不同修復(fù)時間的結(jié)果 同一蠟塊不同修復(fù)時間的結(jié)果 同一蠟塊使用不同修復(fù)液的結(jié)果Ki-67EDTA檸檬酸 同一蠟塊使用不同修復(fù)液的結(jié)果Ki-67EDTA檸檬酸4、操作過程中細節(jié)問題的影響 滴加抗體未完全覆蓋組織，PBS殘留過多，操作過程中切片干燥等原因，會出現(xiàn)邊緣效應(yīng)和染色不均勻及北京染色等。4、操作過程中細節(jié)問題的影響抗體覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)抗體覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)抗體覆蓋不均勻的灶狀著色抗體覆蓋不均勻的灶狀著色影響免疫組化染色質(zhì)量的因素5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響 使用不同克隆、不同種屬來源的抗體，不同的檢測系統(tǒng)，免疫組化的染色會產(chǎn)生差異。 使用三步法試劑盒如SP法生物素系統(tǒng)進

6、行免疫組化染色時，如果操作不當(dāng)會產(chǎn)生較強的背景染色。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響影響免疫組化染色質(zhì)量的因素6、顯色劑、復(fù)染劑的影響 不同的DAB顯色試劑盒、不同的顯色時間，會對免疫組化染色強度及級別判斷產(chǎn)生影響。 蘇木素復(fù)染過深、過淺，對比都不清晰。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素6、顯色劑、復(fù)染劑的影響 DAB顯色恰當(dāng)GST- DAB顯色恰當(dāng)GST-DAB顯色恰當(dāng)CK5/6DAB顯色恰當(dāng)CK5/6Ki-67Ki-67胸腔積液離心包埋細胞塊的免疫組化染色TTF-1CK7胸腔積液離心包埋細胞塊的免疫組化染色TTF-1CK7CalponinCalponinTOPOTOPOCK5

7、/6CK5/6P63P63DAB顯色適當(dāng)，蘇木素復(fù)染過淺DAB顯色適當(dāng)，蘇木素復(fù)染過淺二、免疫組化染色的質(zhì)量控制組織固定1、標(biāo)本在離體后應(yīng)立即浸泡于相當(dāng)于標(biāo)本體積810倍的標(biāo)準(zhǔn)固定液中，大標(biāo)本要剖開固定。離體后標(biāo)本固定前存放不得超過30分鐘。2、在實際工作中，就可操作性而言，10%的緩沖福爾馬林是兼顧保存組織形態(tài)和抗原性通行的、被廣泛接受的選擇。3、適度、適時的固定。一般而言，大標(biāo)本只要做到及時切開固定，在室溫下12小時即可達到固定要求；為了適應(yīng)免疫組化染色標(biāo)準(zhǔn)化的需要，標(biāo)本固定后應(yīng)及時取材，通常固定時間不得超過24小時。4、達到固定時間要求而不能及時進入脫水程序的標(biāo)本，建議將標(biāo)本置入70%的

8、乙醇中進行暫時保存直至進入組織脫水程序。二、免疫組化染色的質(zhì)量控制組織固定免疫組化染色的質(zhì)量控制脫水及制片1、建立嚴格的組織脫水試劑規(guī)范化更換制度，保證組織處理質(zhì)量。2、切片厚度一般34m，厚薄均勻、平整，無刀痕、折疊，采用高質(zhì)量防脫載玻片。3、切片在60烤箱內(nèi)烤23小時，或者70 烤箱內(nèi)1小時。4、脫蠟要和常規(guī)切片分開，使用單獨的二甲苯，如果溫度過低或二甲苯使用次數(shù)較多，可適當(dāng)延長脫蠟時間。免疫組化染色的質(zhì)量控制脫水及制片免疫組化染色的質(zhì)量控制抗原修復(fù)抗原修復(fù)的方式有多種，熱修復(fù)一般推薦高壓鍋熱修復(fù)法，但是微波修復(fù)也有其方便的一面。影響抗原修復(fù)的基本因素是加熱的溫度和加熱的時間，以及所使用的

9、修復(fù)液的PH值。需要操作者在實際工作中摸索總結(jié)，同時要根據(jù)每種抗體的具體要求，找到較適合的修復(fù)方式?？乖迯?fù)的恰當(dāng)與否，直接關(guān)系到免疫組織化學(xué)染色的成敗，進一步影響最后結(jié)果的正確判讀。免疫組化染色的質(zhì)量控制抗原修復(fù)免疫組化染色的質(zhì)量控制抗體及檢測系統(tǒng)的選擇選擇優(yōu)良的抗體和檢測試劑盒，新買抗體要進行敏感性測試，找到最佳的抗原修復(fù)條件，每次試驗要設(shè)置相應(yīng)的陽性和陰性對照。試劑的使用一定在其有效期內(nèi)，同時經(jīng)常觀察抗體使用過程中的結(jié)果變化，如不理想要及時更換。免疫組化染色的質(zhì)量控制抗體及檢測系統(tǒng)的選擇同一病例的ER表達情況選擇優(yōu)良的抗體和檢測試劑盒，新買抗體要進行敏感性測試，找到最佳的抗原修復(fù)條件，每

10、次試驗要設(shè)置相應(yīng)的陽性和陰性對照。過度的固定會造成抗原決定簇的封閉和抗原的丟失。同一蠟塊不同修復(fù)方式的結(jié)果1、標(biāo)本在離體后應(yīng)立即浸泡于相當(dāng)于標(biāo)本體積810倍的標(biāo)準(zhǔn)固定液中，大標(biāo)本要剖開固定。5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響抗原修復(fù)的恰當(dāng)與否，直接關(guān)系到免疫組織化學(xué)染色的成敗，進一步影響最后結(jié)果的正確判讀。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素離體后標(biāo)本固定前存放不得超過30分鐘。影響免疫組化染色質(zhì)量的因素同一蠟塊不同修復(fù)方式的結(jié)果抗體覆蓋組織不完全造成的邊緣效應(yīng)2、在實際工作中，就可操作性而言，10%的緩沖福爾馬林是兼顧保存組織形態(tài)和抗原性通行的、被廣泛接受的選擇。5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響二、免疫組化染色的質(zhì)量控制免疫組化染色的質(zhì)量控制顯色和復(fù)染不要忽視顯色過程，和常規(guī)染色類似，顯色不恰當(dāng)也會造成染色的前功盡棄。不同的組織、不同的抗體顯色時間有差異，必要時使用顯微鏡觀察切片的顯色效果。蘇木素復(fù)染過深過淺都會造成對比不清晰，不利于觀察評價。同一病例的ER表達情況免疫組化染色的質(zhì)量控制顯色和復(fù)染免疫組化染色的質(zhì)量控制影響免疫組化染色的因素