感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)課件

1、感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)Molecular diagnosis for infectious diseases感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)感染的慨念 感染是病原體和人體之間的相互作用過程 病原體：衣原體、螺旋體、病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲、寄生蟲 病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染的慨念 感染是病原體和人體之間的相互作用過程微人微人不共 感染后果（轉(zhuǎn)歸） 病原體被清除 - 通過非特異性或特異性免疫隱性感染 - 是感染過程中最常見的類型顯性感染（臨床感染） - 感染致病，慢性感染引起炎癥潛伏性感染潛伏感染期間

2、，病原體一般不排出體外病原攜帶狀態(tài) - 可以沒有臨床癥狀，而能排出病原體帶病原體的種類不同：帶病毒者、帶菌者與帶蟲者不同攜帶狀態(tài) 潛伏期攜帶者、健康攜帶者、急性與慢性攜帶者是很多傳染病的重要傳染源 感染后果（轉(zhuǎn)歸） 病原體被清除 - 通過非感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略一般性檢出策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR 雜交完整性檢出策略：檢出病原體分型（分類）亞型耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略一般性檢出策略（檢出病原體）：感染性疾病分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免

3、疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)感染性疾病分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA定性或定量檢測病原體的核酸，已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的診斷動(dòng)態(tài)、定量地檢測病原體核酸，能對療效判斷和病情預(yù)后評價(jià)提供客觀的依據(jù)感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)臨床價(jià)值定性或定量檢測病原體的核酸，已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的第一節(jié) 乙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第八章 病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié) 乙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第八章 病毒的分子生物學(xué)病毒核衣殼（nucleocapsid）包膜（envelope）刺突（spike）核

4、酸（nucleic acid） DNA or RNA衣殼（capsid） 衣殼粒核酸蛋白質(zhì)衣殼病毒核衣殼（nucleocapsid）包膜（envelope乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國：50%70%的人受過感染，8%12%是HBV攜帶者 世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長期慢性攜帶者來自亞太地區(qū)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因 mRNA傳染性HBV

5、病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝 細(xì) 胞HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAgHBV基因組結(jié)構(gòu)HBV DNA是帶有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是目前已知感染人類最小的DNA病毒。基因組長為3.2kb長鏈稱為負(fù)鏈用“L(-)”表示，長度是固定的，它攜帶有病毒全部的編碼信息；短鏈稱為正鏈用“S(+)”表示，S(+)在不同的分子中長度不等，大約是負(fù)鏈的50%100%。粘性末端DR區(qū)域是DNA成環(huán)及病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域HBV基因組負(fù)鏈DNA核苷酸序列上含有6個(gè)開放讀碼框架：S、C、P、X 、前-前-S和前-XHBV基因組結(jié)構(gòu)HBV DNA是帶有部

6、分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNHBV基因組結(jié)構(gòu)pre-S1 pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg（S蛋白） pre-C+C HBeAg C HBcAg（C蛋白） P DNAP（P蛋白） X HBxAg（ X蛋白）編碼HBsAgpre-S2S區(qū) C區(qū) P區(qū) X區(qū) 基因重疊HBV基因組結(jié)構(gòu)pre-S1 pre-S1 急性感染時(shí)期HBV的標(biāo)志物HBV 檢測窗口期血清學(xué)（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）急性感染時(shí)期HBV的標(biāo)志物HBV 檢測窗口期普通PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)支鏈DNA技術(shù)（核酸探針雜交標(biāo)記信號放大技術(shù)。支鏈DNA（bD

7、NA）是人工合成的帶有許多側(cè)鏈的DNA片段，在每個(gè)側(cè)鏈上都可以標(biāo)記可被激發(fā)的標(biāo)志物。檢測時(shí)，其靶核酸本身不被擴(kuò)增）核酸雜交技術(shù) 雜交捕獲系統(tǒng) 基因芯片技術(shù)HBV分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法普通PCR技術(shù)HBV分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法HBV DNA檢測（PCR）PCR 引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計(jì)。部分常用的引物序列HBV DNA檢測（PCR）部分常用的引物序列進(jìn)行HBV DNA檢測的同時(shí)使其進(jìn)行相對的量化更直接了解乙肝患者體內(nèi)HBV的復(fù)制及傳染性，能準(zhǔn)確地反映出HBV DNA的復(fù)制水平、病程變化和治療恢復(fù)情況等。其特異性高，靈敏度

8、可達(dá)0.01fg，檢測范圍為2.51022.5109copies/ml。HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）進(jìn)行HBV DNA檢測的同時(shí)使其進(jìn)行相對的量化HBV DNA乙型肝炎病毒的耐藥性分析最常用的抗HBV藥物為核苷（酸）類似物，如拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋（adefovir）耐藥性：HBV的高變異性（逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正功能）人體免疫應(yīng)答或疫苗接種等壓力拉米夫定-與dNTP競爭HBV DNAP（逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)）從而抑制復(fù)制起到治療作用。當(dāng)HBV DNAP氨基酸序列發(fā)生改變使HBV DNAP與拉米夫定的結(jié)合能力明顯下降，產(chǎn)生了對拉米夫定的耐藥性。乙型肝炎病

9、毒的耐藥性分析最常用的抗HBV藥物為核苷（酸）類似HBV耐藥檢測（ YMDD突變檢測方法）HBV耐藥檢測（ YMDD突變檢測方法）YMDD突變檢測方法1. 基因測序法2. 熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點(diǎn)熒光雙探針雜交 YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74YMDD突變檢測方法1. 基因測序法 YIDDHBV 基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G

10、型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型 HBV 基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不PCR-RFLP PCR-RDBELISA基因芯片技術(shù)HBV 的基因分型PCR-RFLP HBV 的基因分型HBV的分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床應(yīng)用早期診斷監(jiān)測治療效果（病毒拷貝數(shù)）判斷病情耐藥檢測HBV的分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床應(yīng)用早期診斷第二節(jié) 丙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第二節(jié) 丙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1. 流

11、行病學(xué)史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2. 臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無明顯癥狀。3. 實(shí)驗(yàn)室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA陽性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一HCV的細(xì)胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗HCV一項(xiàng)，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體

12、HCV分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)尤為重要HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一 HCV分子生物學(xué)HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：單股正鏈RNA，全長9.5 kb僅一個(gè)開放讀框（ORF），編碼一條含有3010 3033個(gè)氨基酸的病毒前體多肽 HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒 HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實(shí)性不高，所以引起HCV的基因型呈多樣性HCV分為6個(gè)（IVI）主要基因型（Simmonds），各型又由若干亞型（a、b、c）組成HCV RNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案 HCV基因分型的多樣性由于HCV的R

13、NA聚合酶的忠實(shí)性不高，HCV分子生物學(xué)檢驗(yàn)HCV RNA定性定性檢測方法：RT-PCRHCV RNA定性檢測的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測為陽性即可確證HCV感染一次檢測陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復(fù)檢查 HCV分子生物學(xué)檢驗(yàn)HCV RNA定性 HCV分子生物學(xué)檢驗(yàn)HCV RNA定量（病毒載量測定）bDNAreal-time RT-PCR（SOP）1 樣本處理（樣本處理區(qū)）2 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）3 加樣（樣本處理區(qū)） 4 RT-PCR反應(yīng)（檢測區(qū)）HCV基因分型常用方法：測序分析法、RFLP、實(shí)時(shí)熒光PCR、基因型特異性引物擴(kuò)增法、型特異性核酸探針雜交法及基因分型

14、檢測芯片等 HCV分子生物學(xué)檢驗(yàn)HCV RNA定量（病毒載量測定） 第三節(jié) 人類免疫缺陷病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第三節(jié) 人類免疫缺陷病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)human immunodeficiency virus（ HIV ） human immunodeficiency virus（ 全國累計(jì)報(bào)告HIV感染者地理分布 截至2013年9月30日,全國共報(bào)告現(xiàn)存艾滋病病毒感染者約43.4萬例全國累計(jì)報(bào)告HIV感染者地理分布 截至2013年9月30日HIV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制Step 1: BindingStep 2: Reverse TranscriptionStep 3: IntegrationStep

15、 4: ReplicationStep 5: TranslationStep 6: Viral Assembly 靶細(xì)胞：CD4+ T 細(xì)胞HIV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制Step 1: Binding 靶HIV基因組基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同其正鏈RNA分子大小為 HIV-1 9.3 kb 有3 組共8個(gè)基因 HIV-2 9.7 kb 有3 組共9個(gè)基因5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)結(jié)構(gòu) HIV基因組基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同 HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順序（long terminal repeats） gag（group

16、 of antigen)基因：編碼核心蛋白 pol （polymerase）基因：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：編碼包膜蛋白LTRs：不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達(dá)，無種屬特異性第二組：參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因 tat（trans-acting transcriptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）第三組：負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral

17、 protein U） vpr（viral protein R） HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個(gè)區(qū)段，gag和pol基因較少變異，是基因組的保守區(qū)域HIV疫苗研發(fā)難度大 HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gpHIV-1感染后病毒標(biāo)志物的變化 窗口期：檢測抗體 2-12周檢測p24抗原 2-3周 檢測RNA 11天HIV-1感染后病毒標(biāo)志物的變化 窗口期：HIV檢測的分子生物學(xué)檢驗(yàn)HIV抗體檢測（窗口期測p24抗原，可輔助診斷 ）初篩試驗(yàn)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試紙

18、（金標(biāo)試紙，雙抗原夾心法）最短在感染6天之后就可以檢測到 確認(rèn)試驗(yàn)：免疫印跡（Western blot, WB）HIV RNA 定性測定方法：RT-PCR基因芯片技術(shù)集合核酸定性檢測原位雜交 HIV檢測的分子生物學(xué)檢驗(yàn)HIV抗體檢測（窗口期測p24抗原HIV病毒載量（HIV RNA 定量）主要有三種技術(shù)：RT-PCR（最低檢測限為50copies/ml ）bDNA（最低檢測限為50copies/ml）NASBA（最低檢測限為20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)PCR檢測前病毒DNA，對出生

19、48h內(nèi)嬰兒的檢測敏感性為38%，出生14d嬰兒的檢測敏感性可為93% HIV病毒載量（HIV RNA 定量）主要有三種技術(shù)： 人類免疫缺陷病毒的分型HIV由于高錯(cuò)誤率的逆轉(zhuǎn)錄酶、病毒的快速復(fù)制、宿主的免疫選擇作用、不同毒株DNA之間的基因重組等原因，其基因具有很高的變異性。目前，HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol區(qū)的某一段基因片段的分析。常用方法有：序列分析法、異源雙鏈核酸泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)、限制性片段長短多態(tài)性分析、DNA酶聯(lián)免疫技術(shù)、基因芯片技術(shù)、多重PCR技術(shù)等。人類免疫缺陷病毒的分型HIV由于高錯(cuò)誤率的逆轉(zhuǎn)錄酶、病毒的快人類免疫缺陷病毒的耐藥性分析耐藥是抗病毒藥物作用的病毒基因發(fā)

20、生突變的結(jié)果。HIV快速產(chǎn)生的耐藥是影響治療效果的主要因素。已經(jīng)確定的與6類艾滋病抗病毒藥物耐藥有關(guān)的HIV基因突變有200多個(gè)。耐藥性檢測方法種類多，主要集中在耐藥性突變位點(diǎn)的檢測能力和耐藥性突變位點(diǎn)的評價(jià)能力。方法：基因芯片耐藥檢測、等位基因探針雜交、寡核苷酸鏈接分析法與直接測序法等。人類免疫缺陷病毒的耐藥性分析耐藥是抗病毒藥物作用的病毒基因發(fā)第九章 細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)意義：不易培養(yǎng)的病原菌（營養(yǎng)苛求菌）難以培養(yǎng)的病原菌（生長緩慢）鑒定病原菌（分子標(biāo)志物）DNA16S rRNA（屬特異性）23S rRNA耐藥株測定流行株分型一般性檢出策略完整性檢出策略第九章 細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)

21、意義：一般性檢出策略第一節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)核桿菌Mycobacterium tuberculosis，TB WHO2009年全球結(jié)核病控制報(bào)告:全球有1/3人口即17億人感染了結(jié)核桿菌，每1秒鐘就有1人受感染全球現(xiàn)有肺結(jié)核病患者1370萬，結(jié)核病每年發(fā)病人數(shù)為927萬，每年死亡人數(shù)177萬結(jié)核病仍為單一病原菌引起疾病死因的第一位發(fā)病人數(shù)占前五位的國家分別為印度、中國、印度尼西亞、尼日利亞、南非1882年由Robert Koch發(fā)現(xiàn) 結(jié)核桿菌Mycobacterium tuberculosiTB 基因組結(jié)構(gòu)環(huán)狀雙鏈DNA，共有4403765bp

22、（4.4Mb），G+C平均值65.6%共有4033基因功能已知的有1734個(gè)605個(gè)基因編碼的蛋白，可見于其他菌種，推測也在TB中存在（交叉）1694個(gè)未知功能TB 基因組結(jié)構(gòu)環(huán)狀雙鏈DNA，共有4403765bp（4.耐藥機(jī)制（藥物抵抗）酶：藥物水解酶藥物修飾酶（如：乙酰轉(zhuǎn)移酶，很多藥物外排泵系統(tǒng)） 壁：具有高度疏水的細(xì)胞壁，充當(dāng)滲透屏障分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法是直接以結(jié)核桿菌的種屬特有基因和耐藥相關(guān)基因?yàn)闄z測對象耐藥機(jī)制（藥物抵抗）酶：分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法是直接以結(jié)核桿菌的TB 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)涂片染色鏡檢（痰涂片法陽性率低，只有20% 80%，易受其他抗酸性分枝桿菌的污染）分枝桿菌分離培養(yǎng)（結(jié)核病

23、診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但結(jié)核桿菌生長緩慢，增殖一代需1018小時(shí)，生長成可見菌落一般需46周，不利于臨床上的及時(shí)診斷和治療）分枝桿菌素試驗(yàn)（結(jié)核桿菌素試驗(yàn)如果呈陽性，也僅表示結(jié)核感染，并不一定代表患?。┭鍖W(xué)試驗(yàn)（分枝桿菌屬各菌之間抗原有著廣泛的交叉，特異性不強(qiáng)）分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)分子生物學(xué)檢驗(yàn)（分子生物學(xué)檢驗(yàn)） TB 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)涂片染色鏡檢（痰涂片法陽性率低，只有20TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法1. TB DNA檢測方法：PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、線性探針雜交法(LPA)、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)、擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)(AMTDT)、基因芯片技術(shù)、測序等方法檢測

24、標(biāo)本中的TB DNAPCR擴(kuò)增所選靶序列65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色體DNA的重復(fù)序列等擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸雜交法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物的特異性TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法1. TB DNA檢測TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法結(jié)核桿菌基因檢測中部分常用的引物 TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法結(jié)核桿菌基因檢測中部分常用的引物 TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. TB 耐藥性檢測對利福平（一線藥）抗性的檢測靶基因?yàn)閞poB基因90%98%的耐利福平結(jié)核桿菌都檢測到rpoB突變。rpoB基因全長3 543個(gè)堿基。當(dāng)其中507533位密碼子(81bp)的核心區(qū)域耐利福平?jīng)Q定區(qū)(RRDR)發(fā)

25、生突變（點(diǎn)突變或短的插入、缺失突變）時(shí)，使DNA依賴性RNA聚合酶亞單位酶結(jié)構(gòu)改變，利福平不能與細(xì)菌RNA聚合酶亞單位結(jié)合而表現(xiàn)為耐藥。其中以編碼531位氨基酸的堿基TCGTTG和編碼526位氨基酸的堿基CACTAC的突變最常見。 TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. TB 耐藥性檢測TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. TB 耐藥性檢測對異煙肼（一線藥）耐藥靶基因：katG基因、inhA基因等點(diǎn)突變、缺失或插入主要是katG基因的突變，完全缺失占異煙肼耐藥菌株的7%24%，出現(xiàn)于高水平耐異煙肼分離株中，katG隨機(jī)突變占50%70%，常見的點(diǎn)突變是315位AGCACC和463位CGGCTG。inhA基因突變

26、約占異煙肼臨床耐藥株的10%35%。由于inhA結(jié)構(gòu)基因突變造成異煙肼與NADH的親和力下降，或是inhA啟動(dòng)子-15的CT的點(diǎn)突變可能創(chuàng)造一個(gè)強(qiáng)有力的啟動(dòng)，使inhA蛋白過度表達(dá)從而提高對異煙肼活性形式所需的濃度，引起對異煙肼耐藥。TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. TB 耐藥性檢測DNA 測序PCR-SSCPPCR-RFLPPCR-RDB基因芯片技術(shù)TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法DNA 測序TB 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法第二節(jié) 淋病奈瑟菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第二節(jié) 淋病奈瑟菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)淋病奈瑟菌（neisseria gonorrhoeae, NG）淋病的病原菌，革蘭染色陰性雙球菌，1879年首次發(fā)現(xiàn)人是奈

27、瑟菌屬的天然宿主（但對人致病的只有淋病奈瑟菌及腦膜炎球菌），淋病菌多侵犯尿道粘膜，主要通過性傳播 淋病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，確診主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查 淋病奈瑟菌（neisseria gonorrhoeae, NNG 基因組結(jié)構(gòu)淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成測序研究的淋病奈瑟菌菌株之一，它的染色體DNA長度為2.15Mbp，其中G+C含量為52.68%。編碼區(qū)的DNA長度占總長度的78%。共含有2 069個(gè)基因，包括2 002個(gè)具有編碼功能的基因和67個(gè)編碼結(jié)構(gòu)性 RNAs基因。淋病奈瑟菌都含有1至數(shù)個(gè)質(zhì)粒（內(nèi)源性質(zhì)粒）83%菌株含分子量2.6MDa的質(zhì)粒（隱蔽性質(zhì)粒）2%含有24.5MD

28、a的質(zhì)粒（介導(dǎo)自身及耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移）13%同時(shí)含有這兩種質(zhì)粒淋病奈瑟菌與腦膜炎奈瑟菌間具有80%的同源序列（其它細(xì)菌同源性較低） NG 基因組結(jié)構(gòu)淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成測序研NG 實(shí)驗(yàn)室診斷方法傳統(tǒng)的涂片染色法敏感度低，在女性病人中檢出率僅50%左右，也不能確診分離培養(yǎng)法對標(biāo)本和培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高，出結(jié)果慢，且陽性檢出率受影響因素多，難以滿足臨床要求免疫學(xué)方法無論是熒光法還是酶染法，由于分泌物標(biāo)本中的非特異性反應(yīng)嚴(yán)重以及抗體方法間的穩(wěn)定性和條件限制，使推廣應(yīng)用受限分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法敏感、特異，可直接從臨床標(biāo)本中檢出含量很低的病原菌，適于淋病奈瑟菌的快速檢測 NG 實(shí)驗(yàn)室診斷方法傳

29、統(tǒng)的涂片染色法 NG 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法1. PCR目前常用在所有淋病奈瑟菌中普遍存在的編碼外膜蛋白III的結(jié)構(gòu)基因?yàn)榘行蛄幸渤Ｓ枚嗫截惖?6S rRNA基因、CPPB基因（同時(shí)存在于染色體DNA和隱蔽質(zhì)粒上）作為靶序列（為提高檢測的特異性可用巢式PCR） NG 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法1. PCR NG 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)3.連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligase chain reaction, LCR）4.鏈替代擴(kuò)增技術(shù)SDA NG 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法2. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù) 淋病奈瑟菌的耐藥性檢測主要由染色體和質(zhì)粒的基因改變而引起1. 淋病奈瑟菌的主要耐藥基因（1

30、）gyrA和parC基因：gyrA和gyrB基因編碼的DNA旋轉(zhuǎn)酶是氟喹諾酮類藥物作用的靶位。gyrA基因突變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變，阻止氟喹諾酮類藥物進(jìn)入靶位，引起耐藥。gyrA基因突變與淋球菌低水平和中度水平氟喹諾酮類藥物耐藥有關(guān)，而對氟喹諾酮類藥物高水平耐藥是gyrA和parC共同參與基因突變的結(jié)果，gyrA和parC是氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)中的兩個(gè)重要基因。 淋病奈瑟菌的耐藥性檢測主要由染色體和質(zhì)粒的基因改變而引起 淋病奈瑟菌的耐藥性檢測（2）penA、ponA基因：青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)為淋球菌重要的外膜蛋白。編碼PBPs的基因主要有penA、ponA基因，如果上述基因中發(fā)生

31、突變，就會(huì)導(dǎo)致PBPs結(jié)構(gòu)的改變，使PBPs與青霉素的親和力下降，細(xì)胞膜對青霉素的滲透性降低，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。（3）porB基因（4）Mtr系統(tǒng)調(diào)控基因（5）erm基因淋病奈瑟菌耐藥檢測的分子生物學(xué)技術(shù)： DNA 測序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技術(shù) 淋病奈瑟菌的耐藥性檢測（2）penA、ponA基因：青霉素結(jié)第十章 真菌與其它病原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第十章 真菌與其它病原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié) 真菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié) 真菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)真菌（fungus）真核細(xì)胞型微生物，具有典型的細(xì)胞核，有完整的細(xì)胞器真菌的種類繁多（有150余萬種），對人致病的真菌不多，分為四類：

32、病原性真菌條件致病性真菌產(chǎn)毒真菌致癌真菌近年來，真菌病的發(fā)病率有明顯上升趨勢，特別是由念珠菌、曲霉菌和隱球菌所致深部真菌感染，這與臨床上濫用抗生素、激素及使用免疫抑制劑、抗癌藥物導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降有關(guān)。真菌（fungus）真核細(xì)胞型微生物，具有典型的細(xì)胞核，有完病原體培養(yǎng)：臨床常規(guī)病原體培養(yǎng)檢出率低，而且樣本易受污染造成假陽性；病理組織學(xué)檢查由于組織標(biāo)本難以獲得,尤其是深部真菌感染的組織標(biāo)本獲得不易，因此，在臨床應(yīng)用上有其局限性血清學(xué)檢查：主要是檢測體液中的抗原，方法方便快速，但不能精確到真菌的種，且某些食物、藥物也可影響檢測結(jié)果，目前沒有廣泛應(yīng)用于臨床病原體培養(yǎng)：臨床常規(guī)病原體培養(yǎng)檢出率低

33、，而且樣本易受污染造成一、白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)健康人群皮膚、黏膜表面共生的微生物，正常人群帶菌率可高達(dá)40%。它是一種重要的條件致病菌。在免疫功能缺陷者中可引起反復(fù)淺表性黏膜感染或嚴(yán)重系統(tǒng)性感染，最常見的是鵝口瘡和酵母菌性陰道炎。一、白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)健康人群皮膚、黏膜表面共生的白假絲酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)特征白假絲酵母菌的致病因素包括粘附因子、生物膜、菌絲等，因此編碼形成粘附素、生物膜及菌絲體的基因即為致病相關(guān)基因。研究較多的基因是編碼粘附素的ALS基因家族和編碼分泌性天冬氨酸蛋白酶的SAP基因家族。耐藥基因目前發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌耐氟康唑的基因有ERG3、ERG11、CDR1、C

34、DR2、MDR1、FLU1、CAP1等白假絲酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)特征白假絲酵母菌的致病因素包括粘附因白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要包括白假絲酵母菌特異性核酸（DNA、RNA）的檢測、基因分型和耐藥基因分析等1.PCR技術(shù)：普通PCR、實(shí)時(shí)PCR、巢式PCR和多重PCR2.PCR-斑點(diǎn)雜交3.DNA指紋技術(shù)：包括限制性片斷長度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、電泳核型分析4.AP-PCR技術(shù)：任意合成的單個(gè)寡核苷酸引物序列分析6.基因芯片技術(shù)白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要包括白假絲酵母菌特異性核酸（白假絲酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)特征二倍體生物，其基因組長度約為16Mb(單倍體)

35、，有八對同源染色體，電泳核型分析大小為0.52.8Mb 之間。功能基因不均勻的分布在八對染色體上。特點(diǎn)：產(chǎn)生遺傳多樣性的染色體長度多態(tài)性現(xiàn)象，即酵母菌染色體發(fā)生數(shù)值和結(jié)構(gòu)性的重排、相互易位、缺失和個(gè)別染色體的三倍性。突變頻率高，導(dǎo)致白假絲酵母菌適應(yīng)環(huán)境的顯型改變。白假絲酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)特征二倍體生物，其基因組長度約為16第二節(jié) 衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第二節(jié) 衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)衣原體細(xì)胞內(nèi)寄生特性，其分離培養(yǎng)較為困難。衣原體包涵體的形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)定位、染色性等特征，具有鑒別衣原體的意義，所以，以往主要靠涂片尋找包涵體和血清學(xué)試驗(yàn)等方法檢測。衣原體細(xì)胞內(nèi)寄生特性，其分離培養(yǎng)較為困難。沙眼衣原體

36、的分子生物學(xué)檢驗(yàn)人類是沙眼衣原體的自然宿主。主要寄生于機(jī)體黏膜上皮細(xì)胞。沙眼衣原體的沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫生物型與人類疾病密切相關(guān)，根據(jù)其主要外膜蛋白（MOMP）的抗原部分又分為18種血清型。沙眼衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)人類是沙眼衣原體的自然宿主。沙眼衣原體的基因組結(jié)構(gòu)特征沙眼衣原體原體和始體內(nèi)皆含有DNA和RNA兩種核酸。如：沙眼衣原體血清型D基因組大小為1.04Mb，G+C含量占41.3%，整個(gè)基因組有894個(gè)蛋白編碼的基因外膜主蛋白基因?yàn)槿旧w基因組的一部分，包括5個(gè)保守區(qū)和4個(gè)可變區(qū)。沙眼衣原體存在特別強(qiáng)的DNA修復(fù)和重組系統(tǒng)，但衣原體作為一種胞內(nèi)寄生菌，其基因組和其他細(xì)菌以及宿主細(xì)

37、胞間都有廣泛的遺傳交換。沙眼衣原體的基因組結(jié)構(gòu)特征沙眼衣原體原體和始體內(nèi)皆含有DNA沙眼衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要包括沙眼衣原體特異性核酸（DNA、RNA）的檢測、基因分型和耐藥基因分析。1.PCR技術(shù)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 、巢式PCR、競爭性PCR引物序列多選自下列三種基因：主要外膜蛋白基因、隱蔽性質(zhì)粒DNA和16S rRNA基因序列2.LCR技術(shù)3.DNA序列分析沙眼衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要包括沙眼衣原體特異性核酸（DN第三節(jié) 支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)第三節(jié) 支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)支原體( mycoplasma)是一類目前所知能獨(dú)立生活，自行繁殖的最小原核細(xì)胞微生物，區(qū)別于其他原核

38、生物的顯著特點(diǎn)是沒有細(xì)胞壁，因而具有可塑性、可濾過性、易溶解性等生物學(xué)特征。支原體的大小一般在0.20.3m，內(nèi)含一個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA，形態(tài)上呈多形性。對四環(huán)素及大環(huán)內(nèi)酯類等干擾蛋白質(zhì)合成的抗菌藥物敏感。對宿主、器官和組織具有高度的特殊親和性支原體( mycoplasma)是一類目前所知能獨(dú)立生活，自肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)非典型肺炎的病原體粘附于宿主呼吸道上皮細(xì)胞，多在老年人和青少年中引起非典型性肺炎肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)非典型肺炎的病原體肺炎支原體的基因組結(jié)構(gòu)特征肺炎支原體M129株基因組為單一雙股環(huán)狀DNA分子 ，全長816 394bp，G+C含量為40%缺失合成細(xì)胞壁和合成氨基酸的基因；維生素、核酸前體及脂肪酸合成的基因也非常少。MP攜帶著較多的編碼粘附素及變異的表膜抗原基因，從而有利于侵入宿主并逃逸宿主的免疫攻擊。肺炎支原體的基因組結(jié)構(gòu)特征肺炎支原體M129株基因組為單一雙肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要包括其特異性核酸（DNA、RNA）的檢測、基因分型和耐藥基因分析。1.PCR技術(shù) P