SCGE法檢測DNA損傷(包括DNA單鏈斷裂與DNA交聯(lián))

1、 /9瓊脂糖液，與細(xì)胞混合時(shí)瓊脂糖液的溫度3037,溫度過高可引起細(xì)胞損傷，此操作過程力求快速，以免加速細(xì)胞的修復(fù)。2細(xì)胞數(shù)和實(shí)驗(yàn)溫度的影響：（1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)應(yīng)調(diào)至約3.0X105,如果細(xì)胞數(shù)過低，一張片子中細(xì)胞數(shù)太少，很難完成100個(gè)彗星計(jì)數(shù)分析；反之細(xì)胞數(shù)過高，片中細(xì)胞過密，位于不同層面的細(xì)胞相互重疊，難以分析彗星損傷。（2）實(shí)驗(yàn)溫度的控制。樣品應(yīng)置4環(huán)境下進(jìn)行，以抑制或降低核酸內(nèi)切酶等活性，阻止損傷的修復(fù)，從而達(dá)到準(zhǔn)確地檢測初級損傷。已有研究表明一些細(xì)胞斷裂損傷能在1小時(shí)內(nèi)達(dá)到0的修復(fù)，3小時(shí)達(dá)到7口，因此，應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞在分析過程中的溫度。.堿化處理及電泳的條件凝膠內(nèi)的細(xì)胞需在堿性（值

2、10環(huán)境下進(jìn)行處理，其作用一是去除細(xì)胞蛋白質(zhì)，使暴露出來；其次是堿化處理使緊密螺旋結(jié)構(gòu)解旋，損傷片斷及其極性端暴露出來。電泳條件：電壓或電流過大，嚴(yán)重受損傷的細(xì)胞可能出現(xiàn)的拖尾過長，彗星消失而影響結(jié)果，其次是正常的細(xì)胞可能因電壓或電流過大而形成少許拖尾的假陽性結(jié)果。反之，電壓或電流過小，受損傷的細(xì)胞不會出現(xiàn)拖尾，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。電泳的電壓多選用低電壓，一般在150v在電泳過程中電泳液的溫度應(yīng)不超過15（應(yīng)在4條件下進(jìn)行，電泳時(shí)間多在40分鐘。.熒光染色及彗星圖象分析：（1采用熒光劑染色，質(zhì)量濃度在15Um用量為10U。染色15分鐘后即可觀察，視野中明亮熒光的“彗星”被光照時(shí)間一般不易超過2分

3、鐘，以免熒光劑快速衰退而不宜繼續(xù)觀察和拍照。（彗星的圖像分析主要靠肉眼顯微鏡讀片，對損傷程度標(biāo)準(zhǔn)的正確判斷是非常重要的。不同程度損傷可根據(jù)彗星的尾部與其頭部的比率大小分為0、1、23、4五個(gè)等級。0級無拖尾表明無損傷，當(dāng)損傷程度由輕到重，則彗星的尾部逐漸變長變大，頭部逐漸變小熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?。用肉眼觀察判斷的分級需要通過計(jì)算機(jī)彗星圖象分析加以確定，目前已有彗星電腦分析軟件可供使用，如3.0等4?？傊瑖?yán)格控制的各種影響因素，使其真正成為一種可靠、易于掌握和有效的斷裂損傷和修復(fù)檢測的新技術(shù)。作者單位：馬愛國臧金林（26602青1島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)學(xué)系）劉四朝（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院）參考文獻(xiàn)1

4、馬愛國韓秀霞劉四朝等.兩種斷裂損傷檢測方法敏感性比較.遺傳,19，9719:32-34.馬愛國等.不同細(xì)胞氧化損傷及自身修復(fù)能力的分析.癌變畸變突變，199，79:138-142.3prot.ctagainsthydrog.np.roxid.-ind.1,33331.4i,173751313.單細(xì)胞凝膠電泳法檢測單細(xì)胞損傷摘要單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞損傷的檢測。其實(shí)驗(yàn)原理在于損傷的在電場中從核內(nèi)溢出，形成與細(xì)胞核“關(guān)部”相區(qū)別的“尾部”。目前主要用開頭指標(biāo)、距離指標(biāo)強(qiáng)度指標(biāo)、“矩”類指標(biāo)等四類指標(biāo)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。單細(xì)胞凝膠電泳（）又稱慧星試驗(yàn)（）是一項(xiàng)較新的電泳方法。自年被。等人成功

5、地用于檢驗(yàn)單鏈斷裂以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)，已成為一種快速、靈敏、簡便的檢測損傷的方法，廣泛地應(yīng)用于放射損傷、剪切損傷、交聯(lián)的檢測、藥物的遺傳毒性評價(jià)、細(xì)胞凋亡鑒定等工作中1。的檢測原理盡管技術(shù)己應(yīng)用近年，但其檢測單個(gè)細(xì)胞損傷的確切原理還不甚清楚。初步認(rèn)為，各種因素誘發(fā)細(xì)胞損傷后會影響的高級結(jié)構(gòu)，使其超螺旅松散。這種細(xì)胞經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞原位裂解、解鏈等過程后，電泳時(shí)，損傷的從核中溢出，朝陽極方向泳動，產(chǎn)生一個(gè)尾狀帶，未損傷的部分保持球形，二者共同形成“慧星”。在一定范圍內(nèi)，“慧星”的長度（代表遷移距離）和經(jīng)熒光染色后“慧星”熒光強(qiáng)度（代表的量）與損傷程度相關(guān)，這樣就可以定量檢測單個(gè)細(xì)胞中的損傷。的操

6、作方法等人于年描述的具體操作方法，被認(rèn)為是經(jīng)典的操作方法。其主要步驟有：將混有待測細(xì)胞的瓊脂糖鋪于載玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使細(xì)胞裂解，在電泳液中解鏈后水平電泳，洗滌后用結(jié)合熒光染料染色，在熒光顯微鏡下觀察玻片上細(xì)胞的熒光圖像，評價(jià)的損傷程度。改變相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件，可以檢測不同類型的損傷，這是的優(yōu)勢之一5如果在堿性溶液中溶解、解鏈、電泳，可以檢測單鏈斷裂及堿不穩(wěn)定損傷6；如果在冷溶解液中加入高濃度鹽及其它變性劑，中性條件下溶解、解鏈、電泳，則可檢測雙鏈斷裂7的主要計(jì)算指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用熒光顯微鏡將“慧星”圖像放大后拍攝下來進(jìn)行分析。典型的損傷細(xì)胞熒光圖像象慧星一樣頭尾分明。為了根據(jù)圖像評價(jià)的

7、損傷程度，人們設(shè)計(jì)了一系列的計(jì)算指標(biāo)。按其性質(zhì)，大致可分為以下幾類：.形1狀指標(biāo)這是一類比較粗略的指標(biāo)。根據(jù)細(xì)胞熒光圖像是否象慧星一樣頭尾分明將其分為慧星一樣細(xì)胞和非慧星樣細(xì)胞，計(jì)數(shù)一定量細(xì)胞中慧星樣細(xì)胞所占的比例，即慧星樣細(xì)胞發(fā)生率，估計(jì)的損傷程度。這種指標(biāo)可通過鏡下觀察直接得到，方便實(shí)用。.距2離指標(biāo)直接在顯微鏡下或在照片上測出慧星的一些長度數(shù)值，如尾長9,1，即0沿電泳方向“慧星”尾部最遠(yuǎn)端與頭部中心間接的距離；總慧星長度11，即“慧星”電泳方向上的最大長度；尾長與頭部直徑比值12等，以評價(jià)D損傷程度。這些指標(biāo)描述電泳中D泳動的距離，易于測量，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備及圖像處理軟件，而且在損傷

8、因素劑量較大時(shí)，這些數(shù)值的大小與作用劑量之間有較為良好的線性關(guān)系。強(qiáng)度指標(biāo)si等人3最初用S技術(shù)檢測射線對D損傷時(shí)用“慧星”頭部中心處熒光強(qiáng)度與電泳方向上一定距離處熒光強(qiáng)度的比值來描述D的損傷。等人4用“慧星”尾部總熒光強(qiáng)度同“慧星”頭部總熒光強(qiáng)度的比值來表示D的損傷程度。新近有報(bào)道根據(jù)“慧星”尾部熒光強(qiáng)度將細(xì)胞分為五類，由弱到強(qiáng)分別計(jì)為0、1、2、3、4，將個(gè)細(xì)胞的分值加在一起表示D的損傷程度，并證明該數(shù)值與總慧星長度有較好的相關(guān)性。這些指標(biāo)都不同程度地反映了電泳中泳動D的量?！熬亍鳖愔笜?biāo)為反映D損傷，上述距離類指標(biāo)和強(qiáng)度類指標(biāo)均不全面，有實(shí)驗(yàn)證明損傷因素作用劑量增大時(shí)，D損傷程度明顯增加而

9、尾長基本不變。為將二者結(jié)合起來，更全面反映D損傷程度，i等人于199年0首次描述了“尾矩”（taimlome，nTtM）的概念，定義為尾部DN占總D的百分比與頭、尾部中心間距的乘積。作者用實(shí)驗(yàn)證實(shí)該指標(biāo)比上述其它指標(biāo)都優(yōu)越，很快就被廣泛接受。定義時(shí)將“慧星”尾部當(dāng)作一個(gè)整體考慮，將頭、尾部中心間距當(dāng)作損傷D的平均遷移距離。事實(shí)上尾部D由不同D片段組成，不同片段遷移距離不同，即尾部D的分布并不均勻。于是，等人提出“慧星矩”（commeotme，ntCM）的概念。以“慧星”頭部中心點(diǎn)為零點(diǎn)，沿電泳方向?qū)ⅰ盎坌恰卑匆欢ǖ拈g隔分成若干個(gè)區(qū)域（80個(gè)即可），分別測定每個(gè)區(qū)域的熒光強(qiáng)度（Di,代表該區(qū)域D

10、量）、該區(qū)域中心距零點(diǎn)的距離（Xi）、“慧星”總熒光強(qiáng)皮（D.代表總D量），則定義為DiXi/D。實(shí)驗(yàn)表明，損傷因素作用劑量較大時(shí)，與作用劑量間的相關(guān)性比更為密切。近年來該指標(biāo)也有所應(yīng)用7用。與此類似，如果預(yù)先設(shè)置一定的閾值將“慧星”頭尾分開，將尾部分成若干區(qū)域，以各區(qū)域面積Si和平均熒光強(qiáng)度Di的乘積表示該區(qū)域D的量，以頭尾部總面積（Sn、St）與頭、尾部總熒光強(qiáng)度（Dh、Di）的乘積表示頭、尾部的D量，就可變化為“尾部惰性”（ii,i）,表示為SiDiXi2/（ShDhsiDi）（xi為區(qū)域中心到頭部中心的距離）18。用作者通過比較認(rèn)為在描述環(huán)磷酰胺處理后人外周血淋巴細(xì)胞D損傷時(shí)，各種指標(biāo)中值的靈敏度是最高的。值必須借助精密儀器和復(fù)雜的軟件才可得出，日前應(yīng)用很少。S的應(yīng)用前景檢測外界因素對D的損傷，S的檢測結(jié)果同其它檢測方法如程序外D合成（DS）等結(jié)果相關(guān)較好2,而且S能反映細(xì)胞群體中不同類型細(xì)胞對作用因素的不同反應(yīng)，而不僅僅是群體細(xì)胞的平均效應(yīng)水平，為確定遺傳毒性因素的靶細(xì)胞提供了可能，也可用于腫瘤放、化療抗