

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文檔簡(jiǎn)介
1、PAGE 12 -聚木糖酶處理桉木預(yù)水解液制備低聚木糖的研究低聚木糖(xylo-oligosaccharides,XOS)又稱木寡糖,是一種由木糖分子通過-1,4糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖,其主要成分為木二糖、木三糖和木四糖的混合物1。低聚木糖具有較好的理化性質(zhì),例如選擇性增殖腸道益生菌2;降低膽固醇、提高鈣的生物利用度3;抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫力、改善心血管系統(tǒng)4;可滿足糖尿病人及肥胖癥人對(duì)甜度的需求5-6等。因此,低聚木糖被認(rèn)為是目前最有前景的功能性低聚糖之一,廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)7。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)低聚木糖的方法主要有自水解、酸水解、微波降解法和酶水解6。自水解方法操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染,
2、但是對(duì)設(shè)備要求較高,精制過程繁瑣,且產(chǎn)物得率和純度較低。酸水解方法過程簡(jiǎn)單,反應(yīng)迅速,但是對(duì)設(shè)備要求高、反應(yīng)過程不易控制、產(chǎn)物得率低、有毒副產(chǎn)物含量高8。微波降解法加熱方式簡(jiǎn)單方便,具有加熱速率快、可選擇性加熱、對(duì)熱能消耗量少及反應(yīng)副產(chǎn)物少、所得產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn),但多局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段9。酶水解主要是利用內(nèi)切聚木糖酶選擇性切割木糖單元間的糖苷鍵。該方法條件溫和、對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求、易于控制,且制備過程不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物,制備所得低聚木糖產(chǎn)品純度較高,是一種清潔環(huán)保型低聚木糖制備工藝10。據(jù)報(bào)道,目前市場(chǎng)上的低聚木糖大多是由玉米芯、麥麩等農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)而來(lái)6,11。由于這些原料所含雜質(zhì)較多,因此精
3、制工藝較為繁瑣,生產(chǎn)成本高,使低聚木糖產(chǎn)品價(jià)格較高,限制了其在普通食品中的擴(kuò)大應(yīng)用7。近年來(lái),隨著溶解漿市場(chǎng)需求量的不斷提高,預(yù)水解液作為溶解漿生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物其產(chǎn)量日益增加12-13。預(yù)水解液中含有大量的半纖維素,部分企業(yè)將預(yù)水解液與黑液混合燃燒產(chǎn)生熱量,降低了資源利用率14-15。闊葉木預(yù)水解液中的半纖維素糖類主要是低聚木糖和聚木糖,因此是生產(chǎn)低聚木糖的良好資源16-17。利用預(yù)水解液生產(chǎn)低聚木糖不僅可以為企業(yè)帶來(lái)額外的利潤(rùn)收入,同時(shí)可以豐富低聚木糖的生產(chǎn)途徑,符合生物質(zhì)精煉的要求。本研究以桉木預(yù)水解液為原料,首先采用Ca(OH)2、活性炭對(duì)預(yù)水解液進(jìn)行純化,制備得到二級(jí)處理預(yù)水解液,然
4、后通過聚木糖酶處理制備富含木二糖木四糖的三級(jí)處理預(yù)水解液,探討聚木糖酶處理過程中不同因素對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖含量的影響,并對(duì)所制備的低聚木糖產(chǎn)品進(jìn)行分析與表征,為預(yù)水解液中半纖維素的高值化利用提供理論指導(dǎo)。1實(shí)驗(yàn)1.1材料及試劑桉木預(yù)水解液,山東太陽(yáng)紙業(yè)有限公司提供。Ca(OH)2,分析純,天津恒興試劑有限公司;活性炭,磷酸活化、木質(zhì)、過200目,廣東海燕活性炭有限公司;聚木糖酶,酶活70000U,山東隆科特酶制劑公司;KBr,光譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;液體NaOH,色譜純、純度50%,美國(guó)Ther?mo-Fisher公司;木糖、木二糖、木三糖及木四糖,標(biāo)準(zhǔn)品,上海意果科技有
5、限公司;透析袋:MD34、200Da,美國(guó)邁姆生物科技有限公司;商品低聚木糖,食品級(jí),XOS-95,購(gòu)于山東龍力公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1桉木二級(jí)處理預(yù)水解液的制備向桉木預(yù)水解液中加入用量1%(以預(yù)水解液質(zhì)量計(jì))的Ca(OH)2,以150r/min的轉(zhuǎn)速攪拌處理30min,后置于離心機(jī)中以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心3min,取上清液,稱為一級(jí)處理預(yù)水解液;向一級(jí)處理預(yù)水解液中加入用量0.8%(以一級(jí)處理液質(zhì)量計(jì))的活性炭,吸附10min后離心(4500r/min)3min,取上層清液,稱為二級(jí)處理預(yù)水解液。各級(jí)處理預(yù)水解液中木素、木糖、乙酸和糠醛的含量如表1所示。從表1可知,經(jīng)過Ca(O
6、H)2和活性炭處理后,預(yù)水解液中木素脫除率較高為80.3%,糠醛完全脫除,總木糖損失率較低為9.6%。另外,Ca(OH)2處理使聚木糖側(cè)鏈上連接的乙?;撀湎聛?lái)形成乙酸,從而提高了水解液中的乙酸含量。二級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24的含量如表2所示。1.2.2聚木糖酶處理制備三級(jí)處理預(yù)水解液向50mL錐形瓶中各加入20g二級(jí)處理預(yù)水解液,分別加入用量為2、5、10、20U/g的聚木糖酶,將錐形瓶置于恒溫?fù)u床中,以150r/min的轉(zhuǎn)速搖晃處理,探究處理時(shí)間(0.67、1、2、3、6、18h)、處理溫度(45、55、60)和pH值(4.5、5.5、6.5)對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木
7、糖DP24含量的影響。反應(yīng)完成后,將三級(jí)處理預(yù)水解液置于沸水浴中處理10min使聚木糖酶滅活,后置于離心機(jī)中以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心3min,收集上清液用于木糖及低聚木糖DP24含量的檢測(cè)。1.2.3低聚木糖的純化將聚木糖酶處理后的三級(jí)處理預(yù)水解液置入透析袋中透析處理48h,以除去其中剩余的小分子木素等雜質(zhì)。透析完成后,將透析液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分水分,然后將濃縮糖液進(jìn)行冷凍干燥得到低聚木糖產(chǎn)品,用于后續(xù)分析與表征。1.3檢測(cè)與分析1.3.1預(yù)水解液中木糖、低聚木糖及總木糖含量的檢測(cè)取1mL預(yù)水解液稀釋適宜倍數(shù),采用離子色譜儀(ICS-5000型,美國(guó)Thermofisher公司),以D
8、ionexCarboPacTMPA200(3mm250mm)為分析柱,以CarboPacTMPA200(3mm50mm)為保護(hù)柱,柱溫30,取樣25L,采用100mmol/LNaOH與500mmol/LNaOAc溶液,以0.3mL/min的流速梯度淋洗,測(cè)定預(yù)水解液中木糖、木二糖、木三糖、木四糖的含量。預(yù)水解液中總木糖含量的檢測(cè):取5mL預(yù)水解液放入耐壓瓶中,加入174L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的H2SO4,將耐壓瓶密封后放入油浴中,121下反應(yīng)60min,然后取上清液稀釋適宜倍數(shù),按上述方法測(cè)定預(yù)水解液中的木糖含量,即為預(yù)水解液中的總木糖含量。1.3.2紅外光譜(FT-IR)分析取1mg經(jīng)過冷凍干
9、燥后得到的低聚木糖樣品,與100mg干燥的KBr經(jīng)瑪瑙研缽研磨后壓片,置于Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)(Vertex70型,德國(guó)布魯克公司)中測(cè)試,掃描范圍為2504250cm1,掃描次數(shù)為16次。1.3.3熱穩(wěn)定性(TGA)分析取510mg經(jīng)過冷凍干燥后得到的低聚木糖樣品置于坩堝中,在熱重分析儀(Q50型,美國(guó)TA儀器公司)中進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件:以高純度氮?dú)猓?9.99%)為載氣,流量為60mL/min,以10/min的升溫速率從室溫升溫至600。2結(jié)果與討論2.1酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24含量的影響聚木糖酶處理過程中酶用量及處理時(shí)間對(duì)三
10、級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24含量的影響見圖1。注由圖1中數(shù)據(jù)可知,酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP24含量的影響較大,而對(duì)木糖含量影響較小。圖1(a)顯示,在酶用量為2U/g時(shí),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP24的含量呈現(xiàn)先快速增加后逐漸不變的趨勢(shì),原因可能是酶用量較低時(shí),預(yù)水解液中酶分子數(shù)量較少,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),酶分子與反應(yīng)底物不斷結(jié)合,在處理時(shí)間為3h時(shí),幾乎所有的酶分子與反應(yīng)底物結(jié)合,此時(shí)預(yù)水解液中低聚木糖DP24含量較高為12.22g/L;之后,由于預(yù)水解液中剩余的酶分子數(shù)量更少,因此進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間低聚木糖含量變化不明顯。由圖1(b
11、)、圖1(c)可知,在酶用量為5U/g、10U/g時(shí),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP24含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),而且分別在處理6h和3h時(shí)達(dá)到最大值,分別為13.02g/L和13.12g/L。這是由于隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),預(yù)水解液中的聚木糖不斷被降解為低聚木糖,在處理時(shí)間分別為6h和3h時(shí),幾乎所有的聚木糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖,此時(shí),預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP24總量分別為18.84g/L和19.08g/L;由于預(yù)水解液中剩余的聚木糖含量較少,因此進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間,預(yù)水解液中剩余的大量酶分子會(huì)進(jìn)一步切割低聚木糖的糖苷鍵形成木糖,這和預(yù)水解液中木糖含量的提高是一致的。圖1(d
12、)中數(shù)據(jù)表明,在酶用量為20U/g時(shí),酶處理0.67h即可使預(yù)水解液中的低聚木糖DP24含量達(dá)到最大值13.1g/L;進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間,低聚木糖含量不斷降低。這是由于酶用量較高時(shí)預(yù)水解液中的酶分子數(shù)量較高,酶分子與反應(yīng)底物結(jié)合的機(jī)率增加。因此,較短的處理時(shí)間內(nèi)酶分子即可與反應(yīng)底物充分結(jié)合,有效提高了聚木糖水解生產(chǎn)低聚木糖DP24的反應(yīng)速度。由以上分析可知,低酶用量和長(zhǎng)處理時(shí)間或者高酶用量和短處理時(shí)間均可使低聚木糖DP24含量達(dá)到較高值。因此,考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本,較優(yōu)的聚木糖酶用量為2U/g,酶處理時(shí)間為3h。2.2處理溫度對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24含量的影響聚木糖酶處理過程中
13、處理溫度對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP24含量的影響見圖2。圖2中數(shù)據(jù)表明,溫度是影響酶處理效果的重要因素。在處理溫度為45時(shí),預(yù)水解液中低聚木糖DP24含量較低,這是由于溫度較低時(shí)聚木糖酶活性較低,酶反應(yīng)速率較慢。升高處理溫度至55,預(yù)水解液中低聚木糖DP24含量快速提高至12.22g/L,此時(shí)預(yù)水解液中木糖、木二糖、木三糖及木四糖含量分別為5.53、5.69、4.15和2.38g/L,原因是升高處理溫度使反應(yīng)體系中的酶分子與聚木糖分子運(yùn)動(dòng)加快,增加了二者之間的碰撞機(jī)會(huì),有效地提高了酶分子-聚木糖底物絡(luò)合物轉(zhuǎn)變?yōu)榈途勰咎堑乃俣?。之后,進(jìn)一步升高處理溫度至60,預(yù)水解液中低聚木糖DP2
14、4的含量快速降低,這是由聚木糖酶自身的性質(zhì)造成的,聚木糖酶是一種具有特殊催化活性的蛋白質(zhì),在溫度較高時(shí)酶蛋白的構(gòu)象與參與酶促反應(yīng)的功能團(tuán)的離解狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變,使酶分子活力降低或發(fā)生失活17。因此,利用聚木糖酶水解制備低聚木糖時(shí)需要嚴(yán)格控制處理溫度。綜上分析,較優(yōu)的聚木糖酶處理溫度為55。2.3酶解pH值對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24含量的影響聚木糖酶處理過程中pH值對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP24含量的影響見圖3。由圖3中數(shù)據(jù)可知,隨著三級(jí)處理預(yù)水解液pH值的不斷增加,低聚木糖DP24含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),這是由于pH值可以通過改變聚木糖酶的構(gòu)象進(jìn)而影響酶的活性位點(diǎn)
15、與底物的結(jié)合。在pH值為4.5或6.5時(shí),聚木糖酶的構(gòu)象與參與酶反應(yīng)的功能團(tuán)的離解狀態(tài)發(fā)生了改變,使得聚木糖酶活力下降,因此,過低或過高的pH值環(huán)境均不適合聚木糖酶水解制備低聚木糖。另外,圖3顯示,pH值對(duì)預(yù)水解液中木糖含量的影響較小,這是由于內(nèi)切聚木糖酶可以選擇性地切割聚木糖主鏈的-1,4糖苷鍵。由以上分析可知,聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備低聚木糖DP24的較優(yōu)pH值為5.5。2.4較優(yōu)處理工藝條件下不同聚合度低聚木糖DP24含量分布由上述2.12.3分析可知,聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備富含低聚木糖DP24的較優(yōu)工藝條件為聚木糖酶用量2U/g、處理時(shí)間3h、處理溫度55、處理液pH
16、值5.5。在此條件下,三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP24的含量如表3所示。由表3中數(shù)據(jù)可知,聚木糖酶處理對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖含量的影響較小,而對(duì)低聚木糖DP24含量的影響較大。經(jīng)過聚木糖酶處理后,預(yù)水解液中木二糖及木三糖含量分別提高了108.4%、86.9%,而木四糖含量變化不明顯,低聚木糖DP24含量由原來(lái)的7.31g/L提高為12.22g/L,提高了67.2%。在較優(yōu)的酶處理?xiàng)l件下,所得三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP24的含量占原始桉木預(yù)水解液中總木糖含量的56.1%。由以上分析可知,利用聚木糖酶處理桉木預(yù)水解液是制備低聚木糖較為有效的方法。2.5FT-IR分析預(yù)水解液經(jīng)過聚木糖
17、酶處理后所得酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的FT-IR圖如圖4所示。由圖4可知,兩種低聚木糖樣品均在1045、894和1408cm1處出現(xiàn)特征吸收峰。樣品在1045cm1處出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰,是由CO的伸縮振動(dòng)引起,是聚木糖主鏈的特征吸收峰18;894cm1處出現(xiàn)的吸收峰是由糖單元間顯性-糖苷鍵的振動(dòng)引起;1635cm1處的吸收峰是由吸附水的彎曲振動(dòng)引起19;1408cm1處出現(xiàn)的吸收峰是由COO的對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起,為糖醛酸的典型特征峰20,這表明經(jīng)過聚木糖酶處理所制備的低聚木糖產(chǎn)品中含有部分糖醛酸側(cè)鏈。另外圖4顯示,酶解低聚木糖在1730cm1處沒有出現(xiàn)特征吸收峰,這是由于Ca(OH)2處理純
18、化預(yù)水解液過程中,堿性條件下聚木糖側(cè)鏈上的乙?;撀湓斐傻?1。2.6TGA分析聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的TGA圖如圖5所示。由圖5中TG曲線和DTG曲線可知,酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA圖相似。兩種低聚木糖在160前只發(fā)生脫水,從190開始發(fā)生分解,并在310出現(xiàn)最大質(zhì)量損失峰,質(zhì)量損失過程在600完成,之后質(zhì)量損失變化不明顯。由以上分析可知,酶解所得低聚木糖熱降解過程主要分為4個(gè)階段:160前為第一階段,樣品吸熱使樣品中的水分蒸發(fā),這一階段只發(fā)生物理變化;160310為第二階段,在此階段內(nèi)低聚木糖出現(xiàn)解聚轉(zhuǎn)變現(xiàn)象,生成不燃性氣體如CO、CO2、甲酸和乙酸等18;310440為第三階段,在此階段內(nèi),不燃性氣體生成為可燃性氣體19;440后為第四階段,該階段主要發(fā)生炭化反應(yīng),是由CO和CH鍵的進(jìn)一步裂解造成的22。由上述分析可知,利用聚木糖酶處理預(yù)水解液所制備的低聚木糖樣品具有較高的熱穩(wěn)定性。3結(jié)論采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備富含低聚木糖DP24的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化分析,并得出以下結(jié)論。3.1聚木糖酶用量、處理時(shí)間、處理溫度及pH值對(duì)預(yù)水解液中低聚木糖DP24的含量均有較大影響;低酶用量和長(zhǎng)處理時(shí)
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