清開靈干預(yù)新生大鼠缺氧缺血腦皮質(zhì)白介素6及FasL蛋白的實驗研

1、清開靈干預(yù)新生大鼠缺氧缺血腦皮質(zhì)白介素-6及Fas-L蛋白的實驗研【關(guān)鍵詞】腦缺氧；,腦缺血；,新生大鼠；,清開靈；,白介素-6；,Fas-L蛋白摘要：目的討論缺氧缺血腦損傷對新生大鼠HIBD腦皮質(zhì)IL-6放射免疫濃度，F(xiàn)as-L蛋白表達的影響，及清開靈對新生大鼠HIBD的干預(yù)治療作用以及有關(guān)分子機制。方法建立HIBD動物模型后分為放射免疫法測定組和免疫組化測定組，每組又分為清開靈干預(yù)組、生理鹽水對照組、假手術(shù)組，根據(jù)檢測需要，在缺氧缺血后24h，3d，7d作IL-6腦皮質(zhì)勻漿放射免疫濃度測定、Fas-L蛋白免疫組化SP法測定。結(jié)果腦皮質(zhì)組織勻漿IL-6放射免疫濃度pg/l假手術(shù)組、生理鹽水組

2、、清開靈干預(yù)組：24h依次為50.16.2,56.37.1,51.36.8;3d依次為50.66.4,250.311.2,78.18.3;7d依次為51.46.6,345.712.3,81.29.2,生理鹽水組與另兩組分別比擬,24hP均0.05,無明顯變化;3,7d生理鹽水組增加明顯P0.05)清開靈干預(yù)組降低明顯P0.05)。左腦皮質(zhì)Fas-L蛋白表達陽性率假手術(shù)組、生理鹽水組、清開靈干預(yù)組：24h依次為8.043.50,120.206.10,21.105.10;3d依次為8.203.10，87.65.90,13.404.20;7d依次為8.012.80,8.322.90,8.262.83

3、;生理鹽水組與另兩組分別比擬，7dP均0.05，無明顯變化；24h,3d增多明顯P0.05，清開靈干預(yù)組降低明顯P0.05。結(jié)論新生大鼠HIBD后24h，3d,7d腦皮質(zhì)IL-6含量逐漸增高。清開靈能降低新生大鼠HIBD腦皮質(zhì)IL-6的產(chǎn)生量。新生大鼠HIBD后，結(jié)扎側(cè)腦皮質(zhì)fas-L蛋白表達增高。清開靈能抑制新生大鼠HIBD結(jié)扎側(cè)腦皮質(zhì)fas-L蛋白的高表達。關(guān)鍵詞：腦缺氧；腦缺血；新生大鼠；清開靈；白介素-6；Fas-L蛋白EffetsfQingKaiLingntheRadiiunlginentratinsfIL-6,theExpressinfFas-LPrtEininthertexinN

4、enatalRatsafterHypxi-isheiBrainDaageAbstrat：bjetiveTexplretheiunlgihangesfinterleukin-6(IL-6),theexpressinffas-LprtEInfrtexinnebrnratsafterHIBDandtheeffetsfQingKaiLingnthe.ethdsTdivideanialsfrexperientintgrups:IL-6testgrup:Anialseredividedintshagrup,NSgrupandQingKailinggrup,IL-6radiiunlginentratinsf

5、rtexereeasuredat24h,3dand7dafterhypxiaisheiabyradiiunassay.Iunhistheistrygrup:Anialseredividedintshagrup,NSgrupandQingKaiLinggrup.Thehangesfexpressinffas-Lprteineredetetedat24h,3dand7dafterhypxiaisheiabyiunhistheistry.Resultsparingiththeshagrup,thenentratinfIL-6andtheexpressinffas-Lprtein(at24h,3dan

6、d7d)inreasedbviuslyintheligatedsidefthebrainrtexinNSgrup(P0.05.paringithNSgrup,theyerenthentraryinQingKaiLinggrup(P0.05.nlusinThenentratinfIL-6,theexpressinffas-LprteinbeehigherrapidlyafterHIBD.QingKaiLinganinhibittheprdutinfIL-6andtheexpressinffas-Lprtein.Keyrds：erebral-hypxia;erebral-isheia;Nenata

7、lrats;QingKaiLing;IL-6;Fas-Lprtein新生兒缺氧缺血性腦損傷nenatalhypxi-isheibraindaage，HIBD是圍生期中的胎兒或新生兒由于各種因素引起的缺氧缺血，腦血流減少或暫停而導(dǎo)致的一種疾病，是窒息后的嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的常見原因之一，嚴(yán)重的缺氧缺血性腦損害可產(chǎn)生永久性神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，如腦癱，智力低下，學(xué)習(xí)障礙，癲癇等1。由于西藥毒性作用大，療效不肯定。我們試圖從我國中藥寶庫中尋找治療HIBD的有效藥物，觀察其療效和作用機制，現(xiàn)將研究報告如下。1材料與方法1.1動物由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供同窩7日齡Sprague-Dale

8、y大鼠，雌雄不限，平均體重約12.015.8g。1.2試劑1.2.1IL-6放射免疫檢測試劑盒：購自天津九鼎生物工程。1.2.2Fas-L免疫組化染色試劑盒：由武漢博士德生物工程提供。1.2.3清開靈注射劑：購自山西太行山制藥廠。1.3方法1.3.1圍生期HIBD動物模型的制作按照Rie方法，取出生7日齡的SD大鼠。乙醚吸入麻醉12in后仰臥，四肢固定于手術(shù)板上，做頸正中切口游離左側(cè)頸總動脈，4號手術(shù)線結(jié)扎左頸總動脈，縫合切口，于原飼養(yǎng)環(huán)境恢復(fù)2.5h后放入缺氧艙容器中，該容器中連續(xù)灌入37恒溫水，以1.5l/in的速度輸入8%2，92%N2混合氣體，持續(xù)2.5h。1.3.2實驗動物分組處理7

9、2只新生大鼠7日齡隨機分為3大組，每組24只，每大組分為3個時間點小組：24h，3d和7d，每小組8只，一大組為清開靈干預(yù)組，首先用Rie方法建立新生大鼠HIBD模型，于結(jié)扎左側(cè)頸總動脈后恢復(fù)2.5h，缺氧后腹腔注射清開靈10l/kg/d，分別于24h，3d和7d斷頭取腦，用左側(cè)腦皮質(zhì)勻漿作IL-6放射免疫濃度測定，二大組為生理鹽水對照組，根本方法如上，生理鹽水腹腔注射劑量為10lkg-1d-1，3大組為假手術(shù)組，單純游離左側(cè)頸總動脈不結(jié)扎，不缺氧，其余方法如上。免疫組化測定：72只7日齡新生大鼠分組實驗方法如上，于每一時間點取腦，中性甲醛固定脫水，透明，包埋和切片，采用免疫組化SP方法染色，

10、檢測各組皮質(zhì)部位fas-L蛋白的表達。1.4結(jié)果統(tǒng)計分析各項檢測指標(biāo)均以s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進展方差分析，和q檢驗，結(jié)果P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1腦皮質(zhì)IL-6放射免疫濃度測定結(jié)果在實驗中觀察到：與假手術(shù)組相比，生理鹽水對照組腦皮質(zhì)組織勻漿IL-6的放射免疫測定濃度在24h無明顯變化，3d，7d，IL-6增高明顯(P0.05)；與生理鹽水對照組相比，清開靈干預(yù)組腦皮質(zhì)組織勻漿IL-6的放射免疫測定濃度在24h無明顯變化，3d，7dIL-6的放射免疫測定濃度降低明顯(P0.05)。結(jié)果見表1。表13組新生大鼠HIBD腦組織皮質(zhì)部位IL-6放射

11、免疫濃度(略)與假手術(shù)比擬，*P0.05，與生理鹽水對照組比擬，P0.05；n=82.2腦組織皮質(zhì)部位Fas-L免疫組化檢測結(jié)果染成棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，實驗中觀察到，與假手術(shù)組相比，生理鹽水對照組結(jié)扎側(cè)腦皮質(zhì)部位Fas-L在蛋白程度上在7d變化不大，24h,3d表達明顯增高P0.05，與生理鹽水對照組相比，清開靈干預(yù)組在24h,3d表達增高不明顯P0.05，在7d變化不大P0.05。結(jié)果見表2。表23組新生大鼠HIBD腦組織皮質(zhì)部位Fas-L蛋白表達陽性率(略)與假手術(shù)比擬，*P0.05，與生理鹽水對照組比擬，P0.05；n=83討論在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，IL-6主要由膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，包括小膠質(zhì)

12、細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。腦缺血及缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，增殖，并聚集于損傷部位。小膠質(zhì)細(xì)胞激活在腦缺血再灌注中的作用具有雙重性。一是神經(jīng)營養(yǎng)作用，可轉(zhuǎn)化為吞噬細(xì)胞，吞噬死亡神經(jīng)細(xì)胞殘骸和變性的神經(jīng)突觸，合成新的神經(jīng)構(gòu)造；分泌IL-6，干擾素，轉(zhuǎn)化生長因子TGF，胰島素樣生長因子-1和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進組織修復(fù)，支持神經(jīng)元的存活。二是神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，通過與神經(jīng)細(xì)胞的直接接觸，胞內(nèi)吞噬神經(jīng)細(xì)胞，另外釋放，分泌一系列潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)和炎性因子，如氧自由基、超氧化物等而致腦損害2。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有抗原呈遞和分泌細(xì)胞因子等作用。最新研究說明缺血可誘導(dǎo)星形細(xì)胞的壞死與凋亡，

13、正常情況下星形細(xì)胞IL1，IL6與TNF等細(xì)胞因子的RNA表達程度很低，但在缺血時那么表達顯著增加；而且這些細(xì)胞因子的表達程度與缺血時間有關(guān)，在腦缺血后IL1最先表達，TNF次之，IL6表達最晚3，4。此前國外已有人作過腦組織IL-6RNA及其蛋白表達的研究與此結(jié)論相符。IL6是一種重要的細(xì)胞因子。有實驗5將IL6直接注射至大鼠腦內(nèi)，可明顯減輕缺血性腦損害的體積，說明IL6對HIBD腦組織有保護作用。有研究6說明，缺氧缺血可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死，亦存在凋亡過程發(fā)生，有關(guān)“凋亡基因的改變已引起人們的關(guān)注，F(xiàn)as及其Fas-L就是其中的“凋亡基因的一局部。Fas-L多肽是一種35KD膜外表受體蛋白，

14、由319個氨基酸組成，F(xiàn)as-L蛋白胞漿區(qū)的一段6070個氨基酸序列與TNF受體高度同源，對介導(dǎo)細(xì)胞死亡是必須的，稱為死亡域,Fas-L蛋白復(fù)合三聚體具有誘導(dǎo)凋亡的才能，并通過死亡域間的互相作用促進Fas-L蛋白聚合而傳導(dǎo)死亡信號，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-KB，啟動靶細(xì)胞內(nèi)的凋亡程序。實驗顯示Fas-L蛋白表達增多時，凋亡明顯可見，干預(yù)治療后Fas-L蛋白表達減少，說明Fas-L與凋亡親密相關(guān)。還觀察到Fas-L蛋白表達頂峰時間較前，后逐漸減少，這說明它引起凋亡的作用時間較早。本實驗研究說明Fas-L蛋白在正常新生大鼠腦內(nèi)弱表達，缺氧缺血后病變部位出現(xiàn)散在分布的強陽性細(xì)胞，多是凋亡腦細(xì)胞，說明Fas

15、-L與腦細(xì)胞凋亡有直接的關(guān)系，F(xiàn)as-L參與了腦細(xì)胞凋亡的過程，F(xiàn)as-L的作用是HIBD的發(fā)病機制之一。經(jīng)干預(yù)治療后，F(xiàn)as-L的蛋白表達減少。說明早期干預(yù)阻抑了腦細(xì)胞的凋亡進程，對神經(jīng)組織有明顯的修復(fù)保護作用。另外在實驗結(jié)果中，我們觀察到腦損傷后隨著時間的推移，F(xiàn)as-L的蛋白表達明顯減少，顯示Fas-L參與凋亡的作用時間較早。中藥清開靈注射液是在?溫病條辨?安宮牛黃丸的根底上研制而成的一種純中藥復(fù)方針劑，其主要成分有：牛黃、水牛角、珍珠母、黃芩、梔子、金銀花、板藍(lán)根等。研究說明，清開靈注射液具有改善腦循環(huán)，抑制血小板聚集，降低血黏度抑制過氧化脂生成，抗自由基7，對抗興奮性氨基酸對腦組織損

16、傷8等作用。動物實驗也證實，清開靈對缺血性9及感染性10腦損傷均有保護作用。但其抗腦損傷的詳細(xì)機制尚未完全清楚，有動物實驗顯示清開靈可影響腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性和谷氨酸含量11，提示清開靈的作用機制可能與腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，清開靈它能明顯減少腦組織IL-6的分泌，能抑制新生大鼠HIBD結(jié)扎側(cè)腦皮質(zhì)fas-L蛋白的高表達，對缺氧缺血腦損傷有重要康復(fù)作用。參考文獻：1金漢珍，黃德珉，官希吉.實用新生兒學(xué)，第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：624.2劉敬，秦振庭.新生兒缺氧缺血性腦病的免疫學(xué)機制J.國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊，2001，284：175.3YuA,LanLT.Expres

17、sinfinterleukin-1alpha,turnersisfatralphaandinterleukin-6genesinastrytesunderisheiinjuryJ.NeurheInt,2000，26(4/5):369.4artin-AnelA,Garia-AlixA,Pasual-SaledD,etal.Interleukin-6intheerebrspinalfluidafterPerinatalasphyxiaisrelatedtearlyandlateneurlgialanifestatinsJ.Pediatris,1997,100(5):789.5LdhikSA,TubullAV,RthellNJ.erebralinterleukin-6inneurprtetiveduringperanentfalerebralisheiaintheratJ.JerebBldFletab,1998,18(2):176.6蔣犁，湯云珍，黃曉明，等.缺氧缺血大鼠腦細(xì)胞凋亡的研究J.中華