細(xì)胞融合精品課件

1、關(guān)于細(xì)胞融合第一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 又稱體細(xì)胞雜交(Somatic hybridization) 是指將不同來源的原生質(zhì)體（細(xì)胞）相融合并使之分化再生、形成新物種或新品種的技術(shù)。51 細(xì)胞融合的定義第二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 人們很早就發(fā)現(xiàn)在生物界中有自發(fā)的細(xì)胞融合現(xiàn)象。我們知道，無論是遠(yuǎn)緣雜交還是利用多倍體技術(shù)都要先實現(xiàn)有性雜交，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間雜交往往表現(xiàn)為雜交不親合或不能受精或是胚胎早期敗育。 克服遠(yuǎn)緣雜交中的不親和障礙；優(yōu)良性狀改良組合起各種植物的優(yōu)良遺傳性狀，從而培育出理想的新品種。52

2、細(xì)胞融合的意義第四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 進(jìn)行體細(xì)胞融合就可以避開生殖細(xì)胞的受精過程。避免上述種種麻煩，從而在親緣更遠(yuǎn)的物種間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界中所沒有的新物種。 例如，馬鈴薯和番茄通過細(xì)胞融合得到了至今有性雜交未能獲得的屬間雜種薯番茄和番茄薯。第五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 許多研究人員成功地進(jìn)行了不同植物的細(xì)胞融合，并培養(yǎng)出了再生植株后，許多人開始嘗試培育不同種屬的超級雜交植物。年，德國的梅羅帕斯博士用細(xì)胞融合的方法培育出了馬鈴薯（土豆）和番茄的雜交后代薯番茄。他們先用酶液除去馬鈴薯、番茄的細(xì)胞壁，然后將兩種去壁細(xì)胞（原生質(zhì)體）等量混合，在混合液

3、中加進(jìn)聚乙二醇溶液，使原生質(zhì)體緊密粘聚，再用高鈣和高溶液處理，結(jié)果，馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)。其中所育成的“番茄薯”新品種地上部分能結(jié)番茄，地下部分能結(jié)馬鈴薯第六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 存在問題 （1）通過融合將雙親的染色體組相加，往往會造成遺傳上的不穩(wěn)定，雜種細(xì)胞也不易分化成株。 (2)從野生種帶進(jìn)過多的不良基因第七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、對于植物細(xì)胞而言，一般先得到原生質(zhì)體2、通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞3、進(jìn)行雜種細(xì)胞的分檢和培養(yǎng)4、促使雜種細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織、直至形成雜種植株，從而實現(xiàn)基因在遠(yuǎn)緣物種間的轉(zhuǎn)移

4、 由于這個新細(xì)胞得到了來自兩個細(xì)胞的染色體組和細(xì)胞質(zhì)，在適宜的條件下來培養(yǎng)，長成的生物個體就是一個新的物種或品系。53 基本原理及步驟第八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月53 基本原理 新生物第九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 細(xì)胞可以發(fā)生融合的生物范圍是很廣的。到目前為止、已經(jīng)在種間、屬間、科間以及動植物兩界之間都做過細(xì)胞融合的嘗試，但只有體細(xì)胞的無性雜交才是真正意義上的細(xì)胞融合技術(shù)。第十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月融 合 過 程第十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 細(xì)胞融合主要經(jīng)過了以下4步：兩

5、原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近細(xì)胞橋形成胞質(zhì)滲透細(xì)胞核融合其中細(xì)胞橋的形成是細(xì)胞融合最關(guān)鍵的一步第十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月541 植物或微生物原生質(zhì)體的制備 植物和許多微生物細(xì)胞外有一層堅韌的細(xì)胞壁，為了促使這樣細(xì)胞的融合就必須先得到單個細(xì)胞，除去細(xì)胞壁，才能獲得植物原生質(zhì)體或微生物原生質(zhì)球 。因此時于植物和微生物細(xì)胞的融合一般又可稱為原生質(zhì)體融合。 54 融合材料第十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 542 動物單個細(xì)胞的獲得 （一）組織的獲得 (二)組織的消化 第十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 55 細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞融合技術(shù) 生物法 化學(xué)法 物理

6、法細(xì)胞融合的影響因素第十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 物理法 主要包括顯微操作、電場刺激等；化學(xué)法 主要是用聚乙二醇PEG結(jié)合高PH、高鈣離子法； 生物法 有仙臺病毒法等。第十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 具體應(yīng)用時要根據(jù)不同對象選擇不同的細(xì)胞融合方法和條件。 誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合 仙臺病毒HVJ誘導(dǎo)、PEG法、電融合法都適用 植物細(xì)胞融合 常用PEG法和電融合法； 微生物細(xì)胞融合 只適用PEG法第十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 我們知道很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力。它一邊黏接在一個細(xì)胞表面，另外一邊黏接在另一個細(xì)胞表面，從而使兩個細(xì)胞在病毒的作用下

7、靠近發(fā)生凝結(jié)。 仙臺病毒也稱日本血凝病毒HVJ,屬黏液病毒副流感類群，是RNA病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。 551 生物法仙臺病毒法第十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 由于被感染細(xì)胞表面發(fā)生某些改變，使得這些細(xì)胞容易發(fā)生融合，甚至處死的HVJ病毒也具有促進(jìn)細(xì)胞融合的作用。 日本學(xué)者岡田利用仙臺病毒使兩種不同的動物細(xì)胞之間發(fā)生凝集，進(jìn)而融合成一體。第二十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 研究發(fā)現(xiàn)：促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于病毒的膜，被超聲波打碎的病毒膜片仍具有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。 仙臺病毒促使細(xì)胞融合的因素與病毒被膜上的磷脂成分有關(guān)，而與病毒內(nèi)核酸的活性無關(guān)。 仙臺

8、病毒被膜糖蛋白與其促融合的能力有關(guān)。在動物細(xì)胞融合中，仙臺病毒(HVJ)已成為產(chǎn)生細(xì)胞雜種的標(biāo)準(zhǔn)融合劑。第二十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟： (1)兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近 (2)通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用是兩個細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透 (3)兩個原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，融為一體 (4)進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種子細(xì)胞。第二十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核第二十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 55 細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞

9、融合技術(shù) 生物法 化學(xué)法 物理法細(xì)胞融合的影響因素第二十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞融合中的化學(xué)法誘導(dǎo)主要包括：NaNO3誘導(dǎo) NaNO3能中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進(jìn)原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低。高Ca2+和pH誘導(dǎo)法PEG誘導(dǎo)PEG結(jié)合高Ca2+和PH誘導(dǎo)法上面幾種方法中以PEG結(jié)合高Ca2+和PH誘導(dǎo)法最為常用，下面做重點介紹：PEG結(jié)合高Ca2+、PH誘導(dǎo)法第二十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5521 基本原理 聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，商品名卡波蠟，實驗室用的PEG ，平均相對分子質(zhì)量在200-2000之間，一般1000以下

10、者為液體，1000以上者為固體。 1974年人們用它誘導(dǎo)大麥、大豆植物原生質(zhì)體融合，以后又用PEG誘導(dǎo)與用高Ca2+和PH誘導(dǎo)相結(jié)合，極大地提高了融合效率。第二十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月機制 由于PEG分子帶有大量負(fù)電荷，和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下形成靜電鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。第二十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 用高Ca2+和PH溶液把與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子進(jìn)行洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的

11、正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。第二十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 基本原理 開發(fā)較晚，但目前應(yīng)用廣泛。 電融合必須有融合儀和融合板。 原理：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變。使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，至到閉和成完整的膜形成融合體。 物理法第三十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月與PEG法比較，電融合法三大優(yōu)點： 1、融合率高、重復(fù)性強、對原生質(zhì)體傷害小； 2、裝置精巧、方便簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程； 3、免去PEG 誘導(dǎo)后的

12、洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強等等。第三十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電融合儀第三十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月本產(chǎn)品是一臺多功能的細(xì)胞電融合和電穿孔儀，獨特的交流非正弦波 使細(xì)胞雙向電泳排列到一起，然后在微秒級時間內(nèi)轉(zhuǎn)換成直流方波使細(xì)胞融合，融合后的交流脈沖穩(wěn)定雜合細(xì)胞的融合狀態(tài)，大大提高了細(xì)胞融合的效率。電融合儀第三十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、 基本過程 細(xì)胞膜的接觸： 當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串 膜的擊穿：

13、 原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起第三十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 55 細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞融合技術(shù) 生物法 化學(xué)法 物理法細(xì)胞融合的影響因素第三十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 影響植物細(xì)胞融合的因素 植物原生質(zhì)體融合無種屬特異性，與其自身種屬無關(guān)，故其融合效率僅與外界條件有關(guān)。 1、PEG誘導(dǎo)融合的關(guān)鍵是作用時間，尤其是高Ca2+和PH溶液處理時間長短非常重要。 時間過長，原生質(zhì)體損傷嚴(yán)重，融合效率低 過短則不融合。 2、 PEG規(guī)格和純度與融合效率也有關(guān)系。 細(xì)胞融合的影響因素第三十六張

14、，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、在電場誘導(dǎo)融合時，融合率與原生質(zhì)體密度有關(guān)，密度小于104個/ml融合效率較低，大于106個/ml，會融合成團(tuán)。 最適宜的密度是2-8104個/ml。4、在融合液中加入少量CaCI2,既可維持一定電導(dǎo)率，對細(xì)胞也有保護(hù)作用。 另外交變電流的強弱、處理時間長短、電脈沖大小均會影響融合率。 5 、此外，用混合鹽溶液對原生質(zhì)進(jìn)行融合前處理，以及在促融劑中添加伴刀豆蛋白、二甲基亞砜等可提高融合率。第三十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、影響動物細(xì)胞融合的因素 在動物細(xì)胞的融合過程中，除促融劑外，細(xì)胞性質(zhì)、溫度、PH、離子強度、離子種類均可影響

15、細(xì)胞融合率。 1、親本細(xì)胞表面性質(zhì)影響較大，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者容易融合，而表面光滑者較難融合。 2、細(xì)胞種類不同，融合效果也不同，如：腹水癌較易融合，而淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞幾乎不融合。第三十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、細(xì)胞融合時，需要適宜的溫度和運動狀態(tài)。4、細(xì)胞融合過程中，通常耗氧量大，缺氧時不融合。5、有些細(xì)胞融合時需要Ca2+否則不融合。6、最適合的PH為7.4-7.8之間，在此范圍之外，不宜融合。第三十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 不同的融合產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下有著不同的命運。 未融合的原生質(zhì)體和同源融合的原生質(zhì)體能較快地適應(yīng)培養(yǎng)條件而生長發(fā)育。 異源融

16、合體往往因它們發(fā)育緩慢而受到優(yōu)勢生長的親本原生質(zhì)體融合細(xì)胞的抑制，不易發(fā)育成雜種。因此需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。5.6 融合細(xì)胞的選擇第四十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 對于如何篩選雜種細(xì)胞，尚無特定規(guī)律可循，需對不同對象設(shè)計具體的篩選方案和選擇體系，優(yōu)先選擇雜種細(xì)胞，或只允許雜種細(xì)胞生長，以淘汰親本細(xì)胞。5.6 融合細(xì)胞的選擇第四十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 最簡單的選擇方法是利用雙親細(xì)胞形態(tài)和色澤上的差異識別雜種細(xì)胞，但多數(shù)是根據(jù)細(xì)胞生理遺傳上的特性來選擇。比較常用的雜種細(xì)胞篩選方法包括： (1)

17、遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個功能正常等位基因，糾正另外一親本的缺陷，從而令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常功能的原理選擇雜種細(xì)胞。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細(xì)胞長成植株呈綠色，并能成長 第四十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2)抗體互補篩選法；利用親本原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其他毒性物質(zhì)抗性差異來選擇雜種細(xì)胞?？剐酝蛔凅w或抗藥性有差異的可采用這種方法。第四十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (3)生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如：親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于

18、雙親互補作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。第四十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (5)其他方法：采用顯微操作技術(shù)也能把單個異核體分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。因為如果是融合細(xì)胞，就必定具有與雙親本不同的熒光標(biāo)記，所以科學(xué)家發(fā)明了一種普遍適用的方法，即采用無毒的熒光素標(biāo)記雙親原生質(zhì)體。融合后利用一種電子熒光激活選擇器自動分類和選擇融合細(xì)胞。 以上方法中利用選擇性培養(yǎng)基是一個很常用的雜種細(xì)胞選擇方法。第四十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月57 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用舉例 植物原生質(zhì)體融合的研究已有90 多年的歷史。但現(xiàn)代植物細(xì)胞融合技術(shù)研究是從20世紀(jì)60年代才開

19、始的，20世紀(jì)70年代，一些科學(xué)家探討了植物細(xì)胞雜交的內(nèi)容、方法和意義，并提出具有吸引力的以番茄和馬鈴薯為細(xì)胞雜交親本的細(xì)胞雜交模型，推動了原生質(zhì)體融合技術(shù)研究的廣泛開展。此后、逐步形成了通過細(xì)胞雜交進(jìn)行作物改良的新觀念 。第四十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 近年來，科學(xué)家利用以細(xì)胞融合為核心技術(shù)的操作取得了很大的科研成果，雜交育種已成為培育動物新品種的一個有效手段。 如已培育出綿山羊：具有綿羊的卷曲濃密的長毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。第四十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 抗原決定簇：存在于抗原分子表面，決定該抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。 Polyclonal an

20、tibody,PcAb：針對多種抗原決定簇的混合抗體Monoclonal antibody,McAb:由單個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體單克隆抗體生產(chǎn)第四十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的特點 1）單克隆抗體是針對單一抗原決定簇的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同的單一抗體，其特異性強，與其對應(yīng)抗原的親和力高度均一； 2）雜種瘤細(xì)胞株可冷凍于液氮中長期保存，所以單克隆抗體可以重復(fù)、穩(wěn)定地制備，不會因批號不同而產(chǎn)生差異； 3）產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤株可在體外擴大培養(yǎng)。單克隆抗體生產(chǎn)第四十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體技術(shù)的建立 1975年英國劍橋大

21、學(xué)分子生物學(xué)實驗室科學(xué)家Kohler和Milstein將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，首次獲得能生產(chǎn)單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。與血液中的多種抗體比較，該雜交瘤細(xì)胞株能持續(xù)分泌成分單一、有特異性的抗體，即單克隆抗體。 兩位科學(xué)家也因此而榮獲了1984年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎單克隆抗體生產(chǎn)第五十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月包括： 動物免疫 細(xì)胞融合 選擇雜交瘤 檢測抗體 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 凍存 單克隆抗體的大量產(chǎn)生要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟單克隆抗體生產(chǎn)第五十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月大致步驟如下： 首先取得抗原，注射到小鼠體內(nèi)，大約注射4次，使

22、小鼠免疫并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。取小鼠的血清與抗原作用，確定產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)。取出免疫小鼠的脾臟制成脾細(xì)胞懸液，與鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，加入聚乙二醇形成融合細(xì)胞，又叫雜交瘤。單克隆抗體生產(chǎn)第五十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月它具有分泌抗體又能迅速生長的特性，稱為單克隆抗體雜交株。單克隆抗體大量制備過程： 細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備 細(xì)胞融合與雜交瘤選擇 抗體的檢測與雜交瘤選擇 單克隆抗體的大量生產(chǎn) 單克隆抗體的鑒定第五十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.7.1.1 細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備 (一) 動物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備 一般經(jīng)過三次免疫過程：初次免疫、第二次免疫、加強免疫。取加強

23、免疫3天后的脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。 （二）骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng) 骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)與免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。第五十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 在準(zhǔn)備融合兩周前開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，利用一般動物細(xì)胞培養(yǎng)液，小牛血清在10%-20%，細(xì)胞最大密度不超過106/ml， 每3-5天傳代一次。第五十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.7.1.2 細(xì)胞融合與雜交瘤選擇 (一)細(xì)胞融合流程 1、取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)基混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。 同時制備脾細(xì)胞懸液，用不完全培

24、養(yǎng)液洗滌2次。第五十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，用不完全培養(yǎng)液洗滌1次。離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。 3、30s內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG,(聚乙二醇) ，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全液，終止PEG作用。第五十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 4、離心，棄上清，用20小牛血清等輕輕混懸，將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100ul孔，37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（二）HAT選擇雜交瘤 一般在融合24h后，加HAT選擇培養(yǎng)液，在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶

25、或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。 維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷氨基喋呤第五十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.7.1.3 抗體的檢測與雜交瘤選擇 篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法。 一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。第五十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月常用的方法有： 1)ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等

26、McAb的檢測。 2)RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb 的檢測。 3)FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。 4)IFA（免疫熒光法）用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。第六十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的應(yīng)用1）臨床診斷及治療：診斷各類病原體：如乙肝病毒、EB病毒等。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的檢測如AFP、CEA等檢測淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志如CD3、4、8等“生物導(dǎo)彈”以McAb作為載體攜帶某些藥物或毒素，將其攜帶至靶器官，從而有效地發(fā)揮藥物作用，直接殺傷靶細(xì)胞。第六十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的應(yīng)用2） 免疫學(xué)研究

27、： 簽定、區(qū)分各種抗原； 檢測大分子抗原上不同的抗原決定簇，鑒定各種組織之間的相容性，尋找與腫瘤或其他細(xì)胞表面抗原結(jié)合的優(yōu)良試劑等； 對免疫球蛋白基因的定位及表達(dá)進(jìn)行研究工作，分析免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)，研究免疫球蛋白基因的結(jié)構(gòu)和多樣性。 大分子蛋白的提純： 利用免疫親和層析的方法提純的蛋白類大分子雜質(zhì)低，對產(chǎn)物的起始濃度要求較低。第六十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.7.1.4單克隆抗體的大量生產(chǎn) 方法主要有兩種： (1)體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。 此方法產(chǎn)量低、一般培養(yǎng)液含量為10-60ugml如果大量生產(chǎn)，費用較高。 第六十三張，PPT共

28、七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.7.1.4單克隆抗體的大量生產(chǎn) (2)體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清： A、實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1-3l07個ml接種于小鼠背部皮下、每處注射0.2ml；待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般1020天)則可采血,從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg/ml。但采血量有限。第六十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 B、腹水的制備：常規(guī)是先給小鼠腹腔注射0.5ml 降植烷或液體石臘，1-2周后腹腔注射1l06個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水。密切觀察動物的健康狀況與腹水征象、待腹水盡可能多，而小鼠瀕臨死亡之前，處死小鼠，用滴管將

29、腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml的腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。第六十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.7.1.5 單克隆抗體的鑒定對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。此對其做如下方面的鑒定：（一）特異性的鑒定（二）McAb的Ig類與亞類的鑒定（三）McAb中和活性的鑒定(四) McAb識別抗原表位的鑒定(五) McAb親和力的鑒定 第六十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5716 影響因素分析 出于制備Mc

30、Ab的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素可能有；（一）污染 包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。 一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源小牛血清。 此外，其他添加劑、實驗工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。第六十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5716 影響因素分析 進(jìn)行支原體檢查（對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系） 對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。第六十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）融合后雜交瘤不生長在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素 (1)PFG有毒性或作用時間過長。 (2)小牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。 (3)骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。 (4) HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。第六十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三