核酸分子雜交技術(shù)課件

1、1核酸分子雜交技術(shù)Nucleic acid Hybridization 1核酸分子雜交技術(shù)Nucleic acid Hybridi2主要內(nèi)容第一節(jié) 核酸探針第二節(jié) 核酸分子雜交的類型第三節(jié) 雜交的影響因素2主要內(nèi)容第一節(jié) 核酸探針3回顧：核酸雜交的基本原理一、核酸的結(jié)構(gòu)二、核酸變性與復(fù)性三、核酸分子雜交的基本原理3回顧：核酸雜交的基本原理一、核酸的結(jié)構(gòu)4一、核酸的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列順序穩(wěn)定鍵：磷酸二酯鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定鍵：氫鍵、堿基堆積力高級(jí)結(jié)構(gòu)：染色體4一、核酸的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列順序5CGA一級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu) 高級(jí)結(jié)構(gòu)5CGA一級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu) 高級(jí)結(jié)構(gòu)6二、核酸變

2、性與復(fù)性 變性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，DNA的雙螺旋解開變成單鏈，形成無規(guī)則線團(tuán)。6二、核酸變性與復(fù)性 變性（denaturation）:7加熱極端的pH有機(jī)試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）DNA的變性因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件二、核酸變性與復(fù)性7DNA的變性因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性8變性DNA的性質(zhì)：變性能導(dǎo)致DNA 的一些理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變二、核酸變性與復(fù)性溶液粘度降低DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟” 無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度明顯下降溶液旋

3、光性發(fā)生改變變性后DNA分子的對(duì)稱性及局部構(gòu)型改變紫外吸收增加DNA變性后，DNA 溶液的紫外吸收增強(qiáng)雙鏈DNA單鏈DNA單核苷酸8變性DNA的性質(zhì)：變性能導(dǎo)致DNA 的一些理化性質(zhì)及生物學(xué)9二、核酸變性與復(fù)性增色效應(yīng)與溫度有十分密切的關(guān)系，這主要是變性溫度取決于DNA自身的性質(zhì)。融解溫度（ melting temperature，Tm）：在熱變性過程中，DNA的變性會(huì)在一個(gè)狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，當(dāng)紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度9二、核酸變性與復(fù)性增色效應(yīng)與溫度有十分密切的關(guān)系，這主要是10 Tm的影響因素： 1 DNA分子大小和堿基 的組成 2溶液的離子強(qiáng)

4、度 3 pH值 4變性劑 DNA復(fù)雜度對(duì)Tm的影響 二、核酸變性與復(fù)性10DNA復(fù)雜度對(duì)Tm的影響 二、核酸變性與復(fù)性11 DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C 堿基對(duì)越多，Tm 值越高。因G-C堿基對(duì)具有3對(duì)氫鍵，而A-T堿基對(duì)只有2對(duì)氫鍵，DNA中（G+C）含量高顯然更能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，破壞 G-C間氫鍵需比A-T 氫鍵付出更多的能量。 二、核酸變性與復(fù)性11 DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高12雜交雙鏈（hybrid duplex）DNA-DNADNA-RNARNA-RNA二、核酸變性與

5、復(fù)性復(fù)性（renaturation）：指變性 DNA 在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程12雜交雙鏈（hybrid duplex）二、核酸變性與復(fù)性13三、核酸分子雜交基本原理核酸雜交示意圖 分子雜交（molecular hybridization）:單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成異質(zhì)雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。 可以是兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈 13三、核酸分子雜交基本原理核酸雜交示意圖 分子雜交（mol14雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性分子雜交技術(shù)：利用

6、探針（probe）與靶DNA（RNA）雜交，特異性識(shí)別靶DNA（RNA）三、核酸分子雜交基本原理14雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性三、15第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類二、核酸探針的長(zhǎng)度三、核酸探針的標(biāo)記四、核酸探針的檢測(cè)15第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類16第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類核酸探針（nucleic acid probe)：是特定核苷酸序列（單鏈，被標(biāo)記）與靶序列發(fā)生特異性互補(bǔ)（可雜交）雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子16第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類核酸探針（nu17高度特異性探針的來源是否方便制備探針的難易程度第一節(jié) 核酸探針一、

7、核酸探針的種類確定特定核苷酸序列（與靶序列互補(bǔ)）標(biāo)記（檢測(cè)方法）選擇探針的最基本的要求17高度特異性第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類確定18第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類DNA探針cDNA探針DNA探針RNA探針寡核苷酸探針18第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類DNA探針19來源：這類探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列 制備方法:基因克隆的方法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 特點(diǎn):克隆在載體中的DNA片段，可無限繁殖，制備簡(jiǎn)便相對(duì)RNA而言，DNA探針不易降解標(biāo)記方法也較成熟第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類-DNA探針19來源：這類探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因

8、的全部20cDNA（complementary DNA）：是指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子特點(diǎn):不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達(dá)的研究 排除了RNA酶的影響，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn) 第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類-cDNA探針20cDNA（complementary DNA）：是指與m21RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA分子中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交的探針分子水解可用RNA酶去除，本底的干擾低。RNA探針有易降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其廣

9、泛應(yīng)用。 第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類-RNA探針21RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高第一節(jié) 22 特點(diǎn) :探針長(zhǎng)度較短（一般為1750bp） 人工合成（避免天然探針的缺點(diǎn)） 尤其適合點(diǎn)突變的檢測(cè) 由于探針的長(zhǎng)度較短，特異性較低，雜交信號(hào)較弱 ，但經(jīng)過精心設(shè)計(jì)仍可設(shè)計(jì)出非常 特異的寡核苷酸探針 第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類-寡核苷酸探針22 特點(diǎn) :第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的種類-寡23DNA，RNA探針DNA探針：400-500baseRNA探針：不易控制，重組DNA分子線性化的限制性核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)寡核苷酸探針探針長(zhǎng)度：一般要求在1750bp 第一節(jié) 核酸探針二

10、、核酸探針的長(zhǎng)度23DNA，RNA探針第一節(jié) 核酸探針二、核酸探針的24理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)特異：靶序列特異穩(wěn)定：標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值靈敏：標(biāo)記物被檢測(cè)無毒：標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無損傷簡(jiǎn)便：操作簡(jiǎn)單便易：價(jià)格低廉第一節(jié) 核酸探針三、核酸探針的標(biāo)記24理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)第一節(jié) 核酸探針三25常用的探針標(biāo)記物：放射性同位素標(biāo)記：32P非放射性同位素標(biāo)記：生物素，地高辛，熒光素 第一節(jié) 核酸探針三、核酸探針的標(biāo)記25常用的探針標(biāo)記物：第一節(jié) 核酸探針三、核酸探針的261隨機(jī)引物法 （單鏈） 2.缺口平移法（雙鏈）第一節(jié) 核

11、酸探針三、核酸探針的標(biāo)記261隨機(jī)引物法 （單鏈） 2.缺口平移法（雙鏈）第一節(jié) 2765末端標(biāo)記 第一節(jié) 核酸探針三、核酸探針的標(biāo)記53末端標(biāo)記 4化學(xué)法全程標(biāo)記 3全程RNA探針標(biāo)記 生物素-親和素地高辛-抗地高辛抗體 2765末端標(biāo)記 第一節(jié) 核酸探針28第一節(jié) 核酸探針?biāo)?、探針的檢測(cè)-放射性同位素探針的檢測(cè) 1.放射自顯影將雜交膜與X膠片在暗盒中曝光一定時(shí)間2.液體閃爍計(jì)數(shù)法-計(jì)數(shù)器 雜交膜剪成小塊，真空干燥后轉(zhuǎn)入閃爍瓶，加入閃爍液，在液閃儀上自動(dòng)計(jì)數(shù)28第一節(jié) 核酸探針?biāo)?、探針的檢測(cè)-放射性同位素探針29 1酶促顯色法 2熒光法 3化學(xué)發(fā)光法 4多探針檢測(cè)法 非放射性探針檢測(cè)示意圖

12、第一節(jié) 核酸探針?biāo)?、探針的檢測(cè)-非放射性的探針的檢測(cè) 29 1酶促顯色法 2熒光法 30常用核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)第一節(jié) 核酸探針30常用核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)第一節(jié) 核酸探針31第二節(jié) 核酸分子雜交的類型一、反向點(diǎn)雜交二、Southern印跡雜交三、Northern印跡雜交 四、原位雜交 其它命名如：斑點(diǎn)雜交 菌落雜交 微板酶聯(lián)雜交31第二節(jié) 核酸分子雜交的類型一、反向點(diǎn)雜交32固相雜交 探針 被測(cè)DNA（RNA） 在固體支持物上雜交 容易洗膜液相雜交 探針 被測(cè)DNA（RNA） 在液體中雜交 靈敏度高按照雜交的反應(yīng)條件分為固相和液相雜交兩類：第二節(jié) 核酸分子雜交的類型雜交分類正向雜交（靶序列固

13、定）反向雜交（探針固定）32固相雜交液相雜交按照雜交的反應(yīng)條件分為固相和液相雜33分子雜交技術(shù)一般過程 探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素） 待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化） 雜交（液相，固相，原位雜交） 雜交后處理（去掉非特異雜交分子） 顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析第二節(jié) 核酸分子雜交的類型33分子雜交技術(shù)一般過程 探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素34核酸分子雜交技術(shù)類型 第二節(jié) 核酸分子雜交的類型34核酸分子雜交技術(shù)類型 第二節(jié) 核酸分子雜交的類型35點(diǎn)雜交正向：是將待檢樣（DNA、 RNA 或細(xì)胞）直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定反向：是將探針固定在膜上第二節(jié) 核酸分子雜交的類型一、反

14、向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）1.將標(biāo)記的探針固定在膜上2.真空抽濾3.烘干4.與待測(cè)DNA雜交5.洗脫顯影35點(diǎn)雜交第二節(jié) 核酸分子雜交的類型一、反向點(diǎn)雜交（36反向點(diǎn)雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過程，整個(gè)操作過程簡(jiǎn)便、快速一張膜上可以同時(shí)固定多個(gè)探針，進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)特別適合做點(diǎn)突變第二節(jié) 核酸分子雜交的類型一、反向點(diǎn)雜交36反向點(diǎn)雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過程，整個(gè)操作過程簡(jiǎn)便、快速第二37線粒體DNA的8個(gè)突變位點(diǎn)膜雜交結(jié)果32563290331633943593360636183688野生型突變型3 290 TC 3 593 TC3 394 TC3 618 TC3 316 GA

15、3 606 AG C3 256T G 3 316 A G 3 688 C第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)一、反向點(diǎn)雜交37線粒體DNA的8個(gè)突變位點(diǎn)膜雜交結(jié)果325632903338Southern印跡雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異DNA的一種膜上印跡技術(shù)是由英國(guó)愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern于1975年建立的。主要用于分析基因是否發(fā)生突變第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、Southern印跡雜交38Southern印跡雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異DNA的39DNA變性 中和 Southern印跡 預(yù)雜交 雜交 洗膜 檢測(cè) 第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、Southern印跡雜交39DNA變性 中和 S

16、outhern40 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、Southern印跡雜交40 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、41電轉(zhuǎn)移示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、Southern印跡雜交41電轉(zhuǎn)移示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型二、Sou42Northern印跡(Northern blot)雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的另一種膜上印跡技術(shù)是由Alwine于1977年建立的。后經(jīng)Thomas等人改進(jìn)主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉(zhuǎn)錄情況第二節(jié) 核酸分子雜交的類型三、Northern印跡雜交42Northern印跡(Northern blot)雜交是43

17、Northern印跡雜交流程圖 第二節(jié) 核酸分子雜交的類型三、Northern印跡雜交43Northern印跡雜交流程圖 第二節(jié) 核酸分子雜交44與Southern印跡雜交比較：RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染所用的器材最好與Southern印跡實(shí)驗(yàn)的分開使用RNA變性的方法：不能用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)水解RNA 2-OH變性劑的作用：防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以保持其單鏈線形狀態(tài)第二節(jié) 核酸分子雜交的類型三、Northern印跡雜交44與Southern印跡雜交比較：RNA提取過程中需特別注45原位雜交（In situ hybridization ）是以特定標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞

18、或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并用組化或免疫組化等方法對(duì)其檢測(cè)的技術(shù)。第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四、原位雜交它屬于固相分子雜交的范疇，但有別于其它任何固相核酸分子雜交技術(shù)45原位雜交（In situ hybridization ）46原位雜交技術(shù)除了具有核酸分子雜交的特異性高的特點(diǎn)之外，并可精確定位，因此該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的研究之中其應(yīng)用有以下幾方面：正?；虍惓Ｈ旧w的基因定位應(yīng)用核酸探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交，檢測(cè)基因表達(dá)水平應(yīng)用特異的病原體核酸作為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行雜交，以檢測(cè)有無該病原體的感染等第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四、原位雜交46原位雜交技術(shù)除了具有核酸分子雜交的特異性

19、高的特點(diǎn)之外，并47石蠟包埋組織切片冰凍切片細(xì)胞涂片培養(yǎng)細(xì)胞爬片第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四、原位雜交-原位雜交材料47石蠟包埋組織切片第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四、原48細(xì)胞或組織切片的處理玻片清洗組織和細(xì)胞的固定增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性預(yù)雜交雜交雜交后漂洗結(jié)果檢測(cè)第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四、原位雜交-基本方法48細(xì)胞或組織切片的處理第二節(jié) 核酸分子雜交的類型四49熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）是一種利用非放射性的熒光素標(biāo)記，對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)第二節(jié) 核酸分子雜交的類型熒光原位雜交49熒光原位雜交（flu

20、orescence in-situ 50生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素抗體 地高辛標(biāo)記的抗體與熒光素標(biāo)記的抗地高辛抗體氨乙?；鶡晒猓╝minoacetylfluroence,AAF）-改良探針與抗AAF抗血清等 上述的檢測(cè)系統(tǒng)有直接法和間接法兩種，后者靈敏度更高 第二節(jié) 核酸分子雜交的類型熒光原位雜交-熒光素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)50生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素抗體 第二節(jié) 核51FISH技術(shù)在染色體分析中的應(yīng)用第二節(jié) 核酸分子雜交的類型熒光原位雜交51FISH技術(shù)在染色體分析中的應(yīng)用第二節(jié) 核酸分子雜交52菌落雜交示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型菌落雜交52菌落雜交示意圖第二節(jié) 核酸分子雜交的類型菌落雜交53核酸分子濃度（靶核酸、單鏈探針）高濃度雙鏈探針：自身復(fù)性