蛋白質分離純化步驟

1、一、蛋白質分別純化的一般原則大多數蛋白質在組織細胞中都是和核酸等生物分子結合在一起 程序以獲得高純度的制品。且分別的關鍵步驟、根本手段還是共同的。蛋白質提純的目的是增加產品的純度和產量 性。因此，要分別純化某一種蛋白質，首先應選擇一種含目的蛋白質較豐富的材料。其次， 04 要設法除去變性的蛋白質和其它雜蛋白，從而到達增加純度和提高產量的目的。二、分別純化蛋白質的一般程序分別純化蛋白質的一般程序可分為以下幾個步驟：一材料的預處理及細胞裂開方法有：機械裂開法這種方法是利用機械力的剪切作用勻漿器、研缽等。滲透裂開法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而裂開。反復凍融法那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜承受此法

2、。超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞裂開。酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。(二) 蛋白質的抽提pH 一般要參加外表活性劑tritonX-100 等，使膜構造破壞，利于蛋白質與膜分別。在抽提過程中，應留意溫度，避開猛烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。(三蛋白質粗制品的獲得選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分別開來依據蛋白質溶解度的差異進展的分別。常用的有以下幾種方法：等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分別。鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其自然性質，并能再度溶解而不變性。有機溶劑沉淀法變性，使用該法時，要

3、留意在低溫下操作，選擇適宜的有機溶劑濃度。四樣品的進一步分別純化析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。凝膠過濾層析凝膠過濾層析gel-filtration chromatography又稱為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠Sephadex裝入一個柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有分子大小不同，進入網孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積準時間不同，從而到達分別的目的。纖維素柱層析法該法是利用蛋白質的酸堿性質作為分別的根底。離子交換纖維素celluloseion-exchanger是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網狀構造，有較

4、大的外表積，使蛋白質大分子可以自由通過。因此常用于蛋白質的分別。1羧甲基纖維素CM-纖維素在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團。在中性pH 條件下，羧甲基上的質子可解離下來圖 2-27a，而溶液中帶正電荷的蛋白質分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負電荷結合?？?小取決于彼此間相反電荷基團之間靜電吸引。(2二乙氨基乙基纖維素DEAE-纖維素在中性pH可交換的基團帶負電荷，因此是一種陰離子交換劑。當某一蛋白質混合溶液通過裝有DEAE- pH 和離子強度的緩沖液進展洗脫，轉變蛋白質分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出到達相互分別的目的。親和層析親和層析affinity-chromatography分別技術是依據很多

5、蛋白質對特定的化 配基或配體ligand。親和層析是一種極有效的分別純化蛋白質的方法。例如酶對它的底物具有特別的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白Aconcanavalin A的分別純地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體外表上或稱為間隔臂， spacerarm，使配體與載體之間保持足夠的距離。將這種多糖顆粒裝入肯定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結合將通過柱子而流出圖2-28a。然它蛋白質分別的目的。 三、蛋白質分子量的測定蛋白質分子量測定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。一凝膠過濾法凝膠過濾法測定蛋白質分子量的原理如“分別純化方法”中所述

6、 后能夠進入顆粒的蛋白質也按分子量大小而先后被洗脫下來 應的分子量來。二SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量蛋白質在一般聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子大小量以及分子外形。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中參加了 十二烷基硫酸鈉sodium dodecyl sulfate,SDS。SDS變性并解離成亞基。當蛋白質樣品中參加SDS0.1后，SDS量，因而掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差異。全部結合SDS-SDS了蛋白質之間原有的電荷和外形的差異，電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小。下電泳，依據測得的樣品相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子量。三沉降法蛋白質顆

7、粒在離心場中的沉降速度用每單位時間內顆粒下沉的距離來表示。離心力減去浮力與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數Sedimentation Coefficient。國際上承受Svedberg 單位作為沉降系數的單位，用S 表示，以紀念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞典有名的蛋白質化學家T.SvedberSvedberg或直接稱一個為11013。110132001013s1S200S。蛋白質分別純化的一般程序可分為以下幾個步驟：一材料的預處理及細胞裂開活性。所以要承受適當的方法將組織和細胞裂開。常用的裂開組織細胞的方法有：機械裂開法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞裂開。常用設備有

8、，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。滲透裂開法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而裂開。反復凍融法敏感的蛋白質不宜承受此法。超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞裂開。酶法(二) 蛋白質的抽提通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應依據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要參加外表活性劑十二烷tritonX-100，使膜構造破壞，利于蛋白質與膜分別。在抽提過程中，應留意溫度，避開猛烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。三蛋白質粗制品的獲得差異進展的分別。常用的有以下幾種方法：等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分別。2. 鹽析法2. 鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調整鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其自然性質，并能再度溶解而不變性。3. 有機溶劑沉淀法中