慢性冬眠心肌其中的間質(zhì)重塑

1、慢性冬眠心肌其中的間質(zhì)重塑【摘要】目的：觀察慢性冬眠心肌h間質(zhì)變化及其對(duì)心功能的影響。方法：對(duì)小型豬采用球囊擴(kuò)張及內(nèi)膜剝脫術(shù)，造成心臟左前降支中段狹窄、心肌慢性缺血，建立h模型。24只小型豬被分成：h組和假手術(shù)組，于模型建立后4周、12周終止實(shí)驗(yàn)。心臟切片以he染色，透射電鏡觀察組織形態(tài)學(xué)；以苦味酸天狼星紅(psr)染色，偏光鏡觀察間質(zhì)膠原纖維類(lèi)型和比例；以免疫組化法測(cè)定間質(zhì)糖蛋白、纖維結(jié)合蛋白fn和骨橋蛋白pn；以超聲心動(dòng)圖觀察左室收縮功能。結(jié)果：較之假手術(shù)組1h的間質(zhì)空間擴(kuò)大，成纖維細(xì)胞增多，膠原增生；2h的間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)ivf、血管周?chē)z原容積分?jǐn)?shù)pvf及光密度積分id、fn和pn均明

2、顯增加，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(p0.01)；3psr染色偏光鏡觀察示h組型膠原大量聚集，排列紊亂，型膠原少量，/膠原比例增高；4h組的左室射血分?jǐn)?shù)lvef、左室短軸縮短率lvfs、室壁增厚率%t顯著降低(p0.01)；5膠原纖維含量與lvfs、lvef和%t呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.754-0.872，p0.01)。結(jié)論：慢性冬眠心肌出現(xiàn)間質(zhì)重塑?！娟P(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈疾病；心肌頓抑；纖維膠原類(lèi)；糖蛋白類(lèi)；心室重構(gòu)authrsaddress：departentfardilgy,pepleshspitalffujianprvine,fuzhu,fujian,350007,hinakeyrds：rnary

3、arterydisease;yardialstunning;fibrillarllagens;glyprteins;ventriularredeling慢性冬眠心肌h廣泛存在于心絞痛、心肌堵塞以及不明原因的左室功能不全患者中1，2。以往對(duì)冬眠心肌的研究大多著眼于心肌本質(zhì),而對(duì)心肌間質(zhì)的形態(tài)改變及其病理生理意義關(guān)注較少，本研究旨在討論小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)變化及其對(duì)心功能的影響。1資料與方法1.1動(dòng)物分組槐豬24只，雄性，月齡57個(gè)月,體重2535kg購(gòu)自福建上杭國(guó)家級(jí)槐豬保種場(chǎng)，被隨機(jī)分為4組，h4周組：6只動(dòng)物，自心肌冬眠起點(diǎn)繼續(xù)飼養(yǎng)4周；假手術(shù)4周組：6只動(dòng)物，自假手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)4周；h1

4、2周組：6只動(dòng)物，自心肌冬眠起點(diǎn)繼續(xù)飼養(yǎng)12周；假手術(shù)12周組：6只動(dòng)物，自假手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)12周。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1模型制備：對(duì)實(shí)驗(yàn)組槐豬采用球囊冠脈擴(kuò)張及內(nèi)膜剝脫術(shù)造成冠脈左前降支lad中段狹窄、心肌缺血及慢性心肌冬眠模型。選擇左前降支中段,定量冠狀動(dòng)脈造影(qa)測(cè)定直徑,以球囊血管1.31的比例,球囊壓616at擴(kuò)張并來(lái)回拉3次,每次30s,間隔為1in，形成冠狀動(dòng)脈損傷。假手術(shù)組只進(jìn)展冠脈造影，不進(jìn)展球囊擴(kuò)張。1.2.2冠狀動(dòng)脈造影：分別于術(shù)后4周、12周重復(fù)冠狀動(dòng)脈造影，選擇舒張晚期造影圖像，采用qa技術(shù)定量測(cè)量冠狀動(dòng)脈直徑狹窄率。1.2.3左心室射血分?jǐn)?shù)lvef、左室短軸縮

5、短率lvfs、室壁增厚率%t：分別于術(shù)后2h、4周、12周進(jìn)展超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。詳細(xì)如下：取乳狀肌程度左心室短軸切面圖像，應(yīng)用型超聲心動(dòng)圖連續(xù)測(cè)量3個(gè)不同心動(dòng)周期，每個(gè)測(cè)值均為三次測(cè)值的平均值。采用計(jì)算機(jī)輔助收縮功能定量分析法進(jìn)展%t計(jì)算，%t=(ths-thd)/thd100%,其中ths、thd分別代表收縮末期及舒張末期室壁厚度。1.2.4室壁運(yùn)動(dòng)分析1靜息室壁運(yùn)動(dòng)分析：按照美國(guó)超聲協(xié)會(huì)左心室16節(jié)段劃分法，以目測(cè)半定量法評(píng)估lad供血區(qū)室壁運(yùn)動(dòng)情況(14分):1分為運(yùn)動(dòng)正常；2分為運(yùn)動(dòng)減弱；3分為運(yùn)動(dòng)消失；4分為矛盾運(yùn)動(dòng)。計(jì)算室壁運(yùn)動(dòng)積分指數(shù)(si)，si=各節(jié)段記分之和/總節(jié)段數(shù),正常為

6、1；2腺苷負(fù)荷超聲心動(dòng)圖試驗(yàn)ase：室壁運(yùn)動(dòng)分析3在心電監(jiān)測(cè)下,先以腺苷100g/kgin靜脈連續(xù)推注、持續(xù)5in；假設(shè)未檢出部分心室壁收縮功能變化，繼以最大劑量200g/kgin靜脈連續(xù)推注、持續(xù)5in。室壁收縮功能變化的類(lèi)型分為：持續(xù)改善：代表非心肌缺血；雙相反響：代表存活的冬眠心??；無(wú)變化：代表不存活的壞死心跡1.2.5光鏡觀察：所有心臟標(biāo)本從心尖起，垂直左心室長(zhǎng)軸切成5薄片，取lad所支配的左室前壁(避開(kāi)局灶性心肌堵塞部位)和正常心肌組織，二者都包括心內(nèi)膜至心外膜的全層心肌，按常規(guī)石蠟包埋后，每個(gè)組織塊做連續(xù)5切片。he染色及苦味酸天狼星紅psr染色4。1.2.6透射電鏡觀察：在灌注中

7、性甲醛溶液前分別取假手術(shù)組和h組術(shù)后4周、12周的心室組織13大小各一份，以3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1磷酸鹽緩沖液pbs，ph7.2)于4作前固定，3d后送福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色制片后在日立hu-12a型透射電鏡下觀察。1.2.7膠原面積、含量光密度：定量分析psr染色切片，光鏡下放大100倍，取心肌組織及血管周?chē)M織(避開(kāi)心外膜下區(qū)域，測(cè)定膠原面積所占視野總面積的百分比ivf、pvf，隨機(jī)計(jì)算10個(gè)視野，而后取平均值，同時(shí)測(cè)定同一視野下平均光密度積分(id)，代表膠原含量。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，組

8、間比擬采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)分析采用線性相關(guān)。p0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1一般情況14只豬參與冬眠模型組制作，除1只術(shù)中死于心室顫抖、另1只術(shù)中死于心包填塞外，其余12只豬均順利完成了所有實(shí)驗(yàn)步驟，其中5只豬出現(xiàn)病變中心小灶性心肌壞死(h4周組2只，h12周組3只)。h4周組和h12周組各6只符合慢性冬眠心肌標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)對(duì)照組所有動(dòng)物無(wú)死亡及心肌壞死。2.2冠狀動(dòng)脈狹窄程度在實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)，qa法測(cè)量h4周及h12周組的冠狀動(dòng)脈直徑狹窄率分別為906%及934%。對(duì)照組動(dòng)物冠狀動(dòng)脈造影未見(jiàn)狹窄。2.3超聲心動(dòng)圖室壁運(yùn)動(dòng)分析靜息時(shí)，假手術(shù)組無(wú)室壁運(yùn)動(dòng)障礙，h4周和h12周組la

9、d供血區(qū)域有不同程度室壁運(yùn)動(dòng)障礙情況見(jiàn)表1；ase時(shí)，h4周、h12周組lad供血區(qū)域室壁運(yùn)動(dòng)障礙情況及其變化見(jiàn)表2。表1各組小型豬靜息超聲心動(dòng)圖室壁運(yùn)動(dòng)障礙程度及節(jié)段數(shù)比擬注：h慢性冬眠心跡各組動(dòng)物數(shù)均為6只，按ase的16節(jié)段劃分法左心室節(jié)段數(shù)量均為96下表同。與假手術(shù)組比擬p0.01；與h4周組比擬p0.01。表2腺苷負(fù)荷超聲心動(dòng)圖試驗(yàn)ase室壁運(yùn)動(dòng)障礙程度及節(jié)段數(shù)比擬注：與假手術(shù)組比擬p0.05。2.4光鏡與電鏡觀察假手術(shù)組心肌構(gòu)造無(wú)明顯異常。h4周組心肌纖維數(shù)量減少，走向不規(guī)那么，細(xì)胞變性、水腫、灶性壞死，間質(zhì)中膠原增生；電鏡下局灶性肌絲斷裂、溶解，肌節(jié)紊亂，線粒體腫脹、嵴紊亂、斷裂

10、，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，核周空區(qū)增大；成纖維細(xì)胞增生，核大、高爾基器興旺,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,內(nèi)充滿有形物質(zhì)。h12周組病變更為明顯，肌纖維斷裂溶解，部分細(xì)胞萎縮，間質(zhì)空間擴(kuò)大，大量膠原增生，呈柵欄狀包裹心肌細(xì)胞；電鏡下肌絲肌節(jié)紊亂，肌原纖維脫失，大量小線粒體，t管減少，核畸形，膠原含量明顯增多，部分呈束狀或網(wǎng)狀分布。2.5psr染色偏振光顯微鏡下觀察h組有黃紅色雙折光型膠原大量聚集,排列紊亂,有少量綠色弱雙折光型膠原，/膠原比例增高。h12周組心肌型、型膠原均較h4周組更加明顯和廣泛，平行交織紊亂排列，其中以黃紅色型膠原增加最為明顯。2.6膠原面積、含量光密度定量分析與同期的假手術(shù)組比擬，h4周組心肌間質(zhì)組織

11、ivf、pvf及其id均明顯增加；h12周組與h4周組相比，ivf、pvf及其id增加更為顯著(p均0.01)，見(jiàn)表3、4。表3各組小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)膠原纖維含量的變化注：與假手術(shù)組比擬p0.01；與h4組比擬p0.01。下表同。表4各組小型豬慢性冬眠心肌血管周?chē)z原纖維含量的變化2.7fn、pn表達(dá)陽(yáng)性率免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，不同時(shí)間點(diǎn)h組心肌間質(zhì)組織糖蛋白fn、pn表達(dá)程度均顯著增加(p0.01)，其變化呈上升趨勢(shì)，即h12周組與h4周組相比有明顯增高(p0.01)，見(jiàn)表5。表5各組小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)糖蛋白含量的變化2.8lvef、lvfs和%t心肌冬眠慢性過(guò)程中，

12、心臟的整體和部分收縮功能均呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為h組的lvef、lvfs和%t都比同期的假手術(shù)組顯著降低以及h12周組的lvef、lvfs和%t比h4周組的顯著降低(p均0.01)，見(jiàn)表6。表6各組小型豬慢性冬眠心肌心功能的變化2.9心肌間質(zhì)變化對(duì)心功能的影響對(duì)心肌間質(zhì)各成分變化與超聲心動(dòng)圖測(cè)量的各項(xiàng)心功能指標(biāo)進(jìn)展相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩組指標(biāo)間具有較高程度的負(fù)相關(guān)性，見(jiàn)表7。表7各組小型豬慢性冬眠心肌心功能的相關(guān)性分析注：p均0.013討論心肌冬眠是缺血心肌防止壞死的一種自我保護(hù)機(jī)制，及時(shí)血運(yùn)重建可使冬眠心肌功能恢復(fù)正?；蚪咏?，而延期血運(yùn)重建不僅使冬眠心肌產(chǎn)生細(xì)胞慢性喪失5,6，還可能會(huì)發(fā)生心肌間質(zhì)變

13、化。關(guān)于冬眠心肌的產(chǎn)活力制及其結(jié)局是近年的研究熱點(diǎn)7。本研究觀察到：心肌冬眠后間質(zhì)和血管周?chē)z原纖維含量明顯增多，并隨時(shí)間推移而加重，psr染色顯示型膠原均明顯增生，尤以型膠原大量聚集,排列紊亂,/膠原比例增高。光鏡及電鏡觀察顯示心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，心肌灶性纖維化。提示慢性冬眠心肌存在膠原纖維增生以及膠原類(lèi)型和比例的改變。心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重塑是導(dǎo)致心肌間質(zhì)重塑主要因素，可造成左心室僵硬、舒張功能異常；血管外周纖維化致管壁彈性改變，硬度加大，限制了冠脈舒張，大量膠原蓄積還會(huì)影響心肌細(xì)胞力的產(chǎn)生和傳遞，收縮功能亦會(huì)受損，最終產(chǎn)生心力衰竭。fn為細(xì)胞間質(zhì)中的糖蛋白,參與組織的增生、修復(fù)、纖維化。研究

14、說(shuō)明，在主動(dòng)脈狹窄所致的心肌肥厚中，fn聚積先于膠原聚積，fn和膠原均參與壓力負(fù)荷對(duì)心肌損傷的修復(fù)，fn是更敏感指標(biāo)。在擴(kuò)張型心肌病患者，fnrna含量較正常人增加2倍8。本研究應(yīng)用免疫組化法觀察fn在h中表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，不同時(shí)間點(diǎn)h組間質(zhì)中fn表達(dá)程度均顯著增加，其變化呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明在心肌冬眠過(guò)程中，隨著膠原纖維的大量增生，fn也在心肌間質(zhì)中大量表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：心肌損傷后3d，fnrna表達(dá)即增多，7d時(shí)累積顯著，其作用與損傷修復(fù)有關(guān)，因此我們認(rèn)為，在h中fn表達(dá)增加為慢性低灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損的結(jié)果，反映了冬眠心肌損傷修復(fù)的過(guò)程，但過(guò)度表達(dá)那么說(shuō)明間質(zhì)重塑和纖維

15、化。pn由成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等合成并分泌，可通過(guò)與整合素家族分子或與d44結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)特異性信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)而介導(dǎo)細(xì)胞粘附、遷移和增殖。pn在醛固酮誘導(dǎo)的心臟重塑中起著重要作用，醛固酮受體拮抗劑防止心肌纖維化部分是通過(guò)抑制pn的表達(dá)9。本研究觀察到：h間質(zhì)中pn的表達(dá)明顯增高，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。franggiannis等6的研究說(shuō)明另一種基質(zhì)糖蛋白tenasin在慢性冬眠心肌間質(zhì)的表達(dá)亦明顯增加，因此可以認(rèn)為，基質(zhì)糖蛋白表達(dá)是慢性冬眠心肌間質(zhì)重塑活潑的有力證據(jù)。同時(shí)，我們還觀察到fn和pn在間質(zhì)中的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明間質(zhì)重塑是一進(jìn)展性開(kāi)展的過(guò)程，提示在臨床上應(yīng)盡早進(jìn)展血運(yùn)重建，及

16、時(shí)阻斷病變開(kāi)展。心肌冬眠后可發(fā)生與急性心肌堵塞后類(lèi)似的心室重塑，表現(xiàn)為lvef、%t下降，左室舒張末期容積lvedv及左室重量增加。冬眠心肌本質(zhì)重塑表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、變性、左室重量增加以及通過(guò)細(xì)胞凋亡等使心肌細(xì)胞喪失，心肌功能恢復(fù)不全或延遲恢復(fù)10。本研究相關(guān)分析顯示間質(zhì)重塑與心功能呈高度負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在心肌冬眠的慢性過(guò)程中，心肌間質(zhì)重塑參與了心室重塑發(fā)生，是導(dǎo)致心功能下降的重要因素之一。心室重塑是心臟疾病-終末性心臟病-慢性心衰演變的核心機(jī)制之一，因此，有理由認(rèn)為，冬眠心肌間質(zhì)重塑可能是慢性缺血心肌開(kāi)展為缺血性心肌并慢性心衰的重要病理生理機(jī)制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1iggersh,nielsenss

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