微生物工程教案

1、-. z.微生物工程教案授課教師：愛梅西北師大學生命科學學院2013年4月課程名稱微生物工程課程代碼74022718學分2總學時36理論學時36課程性質(zhì)根底課 專業(yè)必修課 專業(yè)限選課 專業(yè)任選課 教學手段多媒體任課教師愛梅職稱副教授授課時間20122013學年第一學期授課對象2010級生物技術(shù)1班教 學目的與要 求通過系統(tǒng)地講授微生物工程的原理、方法、生產(chǎn)設(shè)備、應(yīng)用及進展，使生物技術(shù)專業(yè)類的學生對微生物工程的最新成就、原理和生產(chǎn)方法等有較全面地了解，擴大學生眼界，使其能夠更加適應(yīng)市場經(jīng)濟的需要。通過本課程的學習使學生將理科的有關(guān)知識與必要的工程技術(shù)有機的結(jié)合起來，使學生既能掌握比擬專業(yè)的理論知

2、識，又能掌握工程技術(shù)方面的根本計算和設(shè)計工藝流程的原理和方法。教 學基 本要 求掌握微生物工程的根本原理及規(guī)律，熟悉微生物工程生產(chǎn)的常用設(shè)備，使學生既學到比擬專業(yè)的微生物學理論知識，又掌握工程技術(shù)方面的根本計算和設(shè)計工藝流程的原理和方法。教 材軍衛(wèi)主編微生物工程第二版主要參考資料微生物工程 (吳松剛 科學 2004微生物工程工藝原理 (汝華) 華南理工大學 2005新編生物工藝學 俞俊棠 化學工業(yè) 2003發(fā)酵工藝原理 熊宗貴 中國藥科大學 2000發(fā)酵工程與設(shè)備 邱立友 中國農(nóng)業(yè) 2007現(xiàn)代生物工藝學 儲炬 華東理工大學 2008微生物發(fā)酵過程多尺度研究與優(yōu)化 嗣良 化學工業(yè) 2003 F

3、ermentation Microbiology and Biotechnology (E. M. T. El-Mansi, C. F. A. Bryce, Arnold L. Demain ) Taylor & Francis 2011院系審閱意見系主任簽字： 年 月 日教學容與學時分配 教學時數(shù)教學容講課實驗小計備 注緒論2學時2學時實驗課單獨開設(shè)第一章 菌種的來源2學時2學時第二章 優(yōu)良菌種的選育2學時2學時第三章 菌種保藏的原理及方法1學時1學時第四章 微生物的代調(diào)節(jié)和代工程3學時3學時第五章 微生物發(fā)酵培養(yǎng)基2學時2學時第六章 發(fā)酵工藝控制8學時8學時第七章 發(fā)酵過程的參數(shù)檢測2學時

4、2學時第八章 微生物反響動力學3學時3學時第九章 培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備3學時3學時第十章 發(fā)酵設(shè)備3學時3學時第十一章 發(fā)酵設(shè)備過程的優(yōu)化與放大概論2學時2學時第十二章 空氣除菌設(shè)備2學時2學時第十三章 微生物工程展望1學時1學時緒論1.1 發(fā)酵及發(fā)酵工程一. 發(fā)酵的定義1，發(fā)酵一詞的來源發(fā)酵Fermentation一詞是拉丁語沸騰fervere的派生詞，它描述酵母作用于果汁或麥芽浸出液時產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象。產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象是由浸出液中的糖在缺氧條件下降解而產(chǎn)生的二氧化碳所引起的。2，狹義 發(fā)酵的定義在生物化學或生理學上發(fā)酵是指微生物在無氧條件下，分解各種有機物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴格地說，

5、發(fā)酵是以有機物作為電子受體的氧化復(fù)原產(chǎn)能反響。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出二氧化碳。同時獲得能量，丙酮酸被復(fù)原為乳酸而獲得能量等等。3，廣義 發(fā)酵的定義工業(yè)上所稱的發(fā)酵是泛指利用生物(微生物或動植物)細胞制造或生產(chǎn)*些產(chǎn)品的過程，它包括厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通氣有氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等的生產(chǎn)。產(chǎn)品既有細胞代產(chǎn)物，也包括菌體細胞、酶等。4，發(fā)酵工程的定義1國際純粹及應(yīng)用化學聯(lián)合會(1981年)將生物化學、生物學、微生物學和化學工程應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程包括醫(yī)藥衛(wèi)生、能源及農(nóng)業(yè)產(chǎn)品及環(huán)境保護的技術(shù)2.國際經(jīng)濟及合作開展組織(1982年

6、)應(yīng)用自然科學及工程學原理、依靠生物作用劑Biological agents的作用將物料進展加工以提供產(chǎn)品或為社會效勞的技術(shù)3. Murry Moo-Young1985年對生物作用和生物物料加以評價和利用，并進展工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)的技術(shù)4. Higgins生物系統(tǒng)或生物過程的工業(yè)利用，它很大程度上取決于對生物系統(tǒng)及其催化作用專門知識的認識。發(fā)酵工程Fermentation Biotechnology應(yīng)用微生物學等相關(guān)的自然科學以及工程學原理，利用微生物等生物細胞進展酶促轉(zhuǎn)化，將原料轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品或提供社會性效勞的一門科學。發(fā)酵過程的組成局部1發(fā)酵過程的組成繁殖種子和發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基組份確定；培養(yǎng)基、

7、發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備的滅菌；培養(yǎng)出有活性、適量的純種，接種入生產(chǎn)的容器中；微生物在最適合于產(chǎn)物生長的條件下，在發(fā)酵罐中生長；產(chǎn)物提取和精制；過程中排出的廢棄物的處理。3發(fā)酵生產(chǎn)的條件*種適宜的微生物保證或控制微生物進展代的各種條件培養(yǎng)基組成，溫度，溶氧pH等進展微生物發(fā)酵的設(shè)備提取菌體或代產(chǎn)物，精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備發(fā)酵工程的地位1. 生物工程重要的組成局部發(fā)酵工程( Fermentation )酶工程 (蛋白質(zhì)工程) (Enzyme engineering & Protein engineering) 基因工程 ( Genetic engineering) 細胞工程 ( Cell engine

8、ering )2. 生物工程中其他技術(shù)產(chǎn)業(yè)化表達的重要手段基因工程菌動植物細胞培養(yǎng)3. 生命科學研究的對象或載體地位基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程二發(fā)酵工程的特點發(fā)酵和其他化學工業(yè)的最大區(qū)別在于它是生物體所進展的化學反響。其主要特點如下：1發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進展的生物化學反響，反響平安，要求條件也比擬簡單。2發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，只要參加少量的有機和無機氮源就可進展反響。微生物因不同的類別可以有選擇地去利用它所需要的營養(yǎng)?；谶@特性，可以利用廢水和廢物等作為發(fā)酵的原料進展生物資源的改造和更新。3發(fā)酵過程是通過生物體的自動調(diào)節(jié)方式來完成的，反響的專一性強

9、，因而可以得到較為單的代產(chǎn)物。4發(fā)酵過程中對雜菌污染的防治至關(guān)重要。除了必須對設(shè)備進展嚴格消毒處理和空氣過濾外，反響必須在無菌條件下進展。如果污染了雜菌，生產(chǎn)上就要遭到巨大的經(jīng)濟損失，要是感染了噬菌體，對發(fā)酵就會造成更大的危害。因而維持無菌條件是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。5由于生物體本身所具有的反響機制，能夠?qū)Ｒ恍缘睾透叨冗x擇性地對*些較為復(fù)雜的化合物進展特定部位地氧化、復(fù)原等化學轉(zhuǎn)化反響，也可以產(chǎn)生比擬復(fù)雜的高分子化合物。6微生物菌種是進展發(fā)酵的根本因素，通過變異和菌種篩選，可以獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株并使生產(chǎn)設(shè)備得到充分利用，也可以因此獲得按常規(guī)方法難以生產(chǎn)的產(chǎn)品。7工業(yè)發(fā)酵與其他工業(yè)相比，投資少，見效快

10、，開可以取得顯著的經(jīng)濟效益。三、發(fā)酵的類型1按發(fā)酵原料來區(qū)分糖類物質(zhì)發(fā)酵石油發(fā)酵廢水發(fā)酵2按發(fā)酵形式來區(qū)分固態(tài)發(fā)酵深層液體發(fā)酵3按發(fā)酵產(chǎn)物區(qū)分氨基酸發(fā)酵有機酸發(fā)酵抗生素發(fā)酵酒精發(fā)酵維生素發(fā)酵酶制劑發(fā)酵4按發(fā)酵工藝流程區(qū)分分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵流加發(fā)酵5按發(fā)酵過程中對氧的不同需求來分厭氧發(fā)酵通風發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)品的類型工業(yè)上的發(fā)酵，有四個主要類別：一、菌體工業(yè)生產(chǎn)的微生物體，可分為二種：1供制備面包用的酵母；2作為人類或動物的食物的微生物細胞單細胞蛋白質(zhì)。二、微生物的酶工業(yè)上，曾由植物、動物和微生物生產(chǎn)酶。微生物的酶可以用發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)，是其最大的優(yōu)點。而且與植物或動物相比，改進微生物的生產(chǎn)能力也方便得多

11、。酶的生產(chǎn)是受到微生物本身嚴格控制。為改進酶的生產(chǎn)能力可以改變這些控制，如在培養(yǎng)基中參加誘導(dǎo)物和采用菌株的誘變和篩選技術(shù)，以消除反響阻遏作用。三、微生物代產(chǎn)物1代產(chǎn)物的類別初級代產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸、脂類和碳水化合物等。次級代產(chǎn)物：有些微生物的穩(wěn)定期培養(yǎng)物中所含有的化合物，并不在營養(yǎng)期時出現(xiàn)，而且未見到對細胞代功能有明顯的影響。例如，抗生素。2初級代產(chǎn)物及其在工業(yè)上的應(yīng)用1第一個階段19世紀以前產(chǎn)品只限于含酒精飲料和醋古埃及已經(jīng)能釀造啤酒2第二個階段1900年1940年主要的新產(chǎn)品是酵母、甘油、檸檬酸、乳酸、丁醇和丙酮在面包酵母的生產(chǎn)中首先采用了分批補料培養(yǎng)技術(shù)在一次大戰(zhàn)時，We

12、izmann開拓了丁醇丙酮發(fā)酵，并建立了真正的無雜菌發(fā)酵3第三個階段1940年以后這以階段的標志是，在純種培養(yǎng)技術(shù)下，以深層培養(yǎng)生產(chǎn)青霉素解決向培養(yǎng)基入大量無菌空氣和高粘度培養(yǎng)液的攪拌問題4第四個階段1960年以后以烴為碳源生產(chǎn)微生物細胞作為飼料蛋白質(zhì)的來源出現(xiàn)了不需要機械攪拌的高壓噴射和強制循環(huán)的發(fā)酵罐工業(yè)上普遍采用分批培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)法5第五個階段1979年以后這個階段以基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)為標志。目前，世界上已經(jīng)批準上市的基因工程藥物就有幾十種，如：胰島素、人生長激素等等。3工業(yè)化成功利用催化生產(chǎn)的有機化合物4微生物酶促轉(zhuǎn)化與化學合成有機結(jié)合5，現(xiàn)代生物技術(shù)的開展1.2 發(fā)酵工程的應(yīng)用一

13、發(fā)酵工程在食品,輕工業(yè)領(lǐng)域的展望高產(chǎn)菌種和特殊環(huán)境微生物的遺傳育種新酶品種開發(fā)和應(yīng)用食品添加劑新品種開發(fā)和應(yīng)用生物技術(shù)產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模的別離和提取二發(fā)酵工業(yè)圍1. 釀酒工業(yè)(啤酒、葡萄酒、白酒等)2.食品工業(yè)(醬、醬油、醋、腐乳、面包、酸乳等)3.有機溶劑發(fā)酵工業(yè)(酒精、丙酮、丁醇等)4.抗生素發(fā)酵工業(yè)(青霉素、鏈霉素、土霉素等)5.有機酸發(fā)酵工業(yè)(檸檬酸、葡萄糖酸等)6.酶制劑發(fā)酵工業(yè)(淀粉酶、蛋白酶等)7. 氨基酸發(fā)酵工業(yè)(谷氨酸，賴氨酸等)8. 核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)(肌苷酸、肌苷等)9. 維生素發(fā)酵工業(yè)(維生素、維生素等)10.生理活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)(激素、赤霉素等)11.微生物菌體蛋白發(fā)酵工

14、業(yè)(酵母、單細胞蛋白等)12.微生物環(huán)境凈化工業(yè)(利用微生物處理廢水、污水等)13.生物能工業(yè)(沼氣、纖維素等天然原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等，能源物質(zhì))14.微生物冶金工業(yè)(利用微生物探礦、冶金、石油脫硫等)三發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域1，醫(yī)藥2，食品3，化工4，紡織5，輕工6，環(huán)保四發(fā)酵罐等生物反響器規(guī)模谷氨酸 100200m3 最大660m3啤酒 600m3露天檸檬酸 220m3酶制劑 90m3 酵母培養(yǎng)罐 170m3黃酒 200m3酒精 51500m3五國外發(fā)酵工業(yè)的開展趨勢1生物轉(zhuǎn)化或生物合成技術(shù)成為國外著名化學公司爭奪的熱點，并逐步從醫(yī)藥領(lǐng)域逐漸向化工領(lǐng)域轉(zhuǎn)移2生物催化合成已成為化學品合成的支

15、柱之一3利用生物技術(shù)生產(chǎn)有特殊功能、性能、用途或環(huán)境友好的化工新材料，是化學工業(yè)開展的一個重要趨勢。4傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)已由基因重組菌種取代或改進。許多傳統(tǒng)的發(fā)酵工程產(chǎn)品如檸檬酸、青霉素等都已開場采用基因工程手段進展改造，大提高了產(chǎn)量。在以基因工程為主導(dǎo)的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品中，醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品占75左右。六國發(fā)酵工業(yè)的開展概況我國傳統(tǒng)發(fā)酵歷史悠久，在黃帝經(jīng)素向、湯液醪醴論里，已有釀酒的記載。白酒的起源，當在元朝以前，尚待考證。醬油的釀造，當始自周朝。在漢武帝時代開場有了葡萄酒，距今已有兩千多年的歷史。數(shù)千年來由于科學技術(shù)進步緩慢，各種微生物工業(yè)也未能充分開展。直到20世紀中期才建立了一系列新的微生物

16、工業(yè)。近幾年來，由于生物新技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)酵工業(yè)開場進入新的開展時期。1白酒中國的釀酒業(yè)，距今已有數(shù)千年的歷史淵源。白酒是我國特有的、具有悠久歷史的傳統(tǒng)酒種。1949年新中國成立時，我國白酒的產(chǎn)量只有108萬t 。1996年，我國白酒產(chǎn)量到達歷史頂峰，總量到達80130萬t。目前，我國白酒的產(chǎn)量為400余噸。2黃酒黃酒是我國最古老的酒種，早在夏、商、周三代就已經(jīng)大量生產(chǎn)了，并流傳至今，據(jù)史料記載已有6000年左右了。目前年產(chǎn)量為130萬噸左右。3啤酒1900年我國最早的啤酒廠于建成1915年國人投資的雙合盛啤酒廠建成1949年啤酒產(chǎn)量僅七千余噸1981年啤酒產(chǎn)量增至91萬噸2001年產(chǎn)量到達22

17、00萬噸左右4葡萄酒1892年華僑弼士在建立釀酒公司，這是我國第一個新型的葡萄酒釀造廠目前我國葡萄酒工廠已有近八十家葡萄酒年產(chǎn)量約30萬噸裕、王朝、長城三家公司占據(jù)50.6的市場份額，銷售收入占整個行業(yè)的61.95醬油和醋早在三千年前便已掌握了醬油和醋發(fā)酵的技法，數(shù)千年來一直沿用自然發(fā)酵法，直到20世紀后才開場采用純種培養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)，目前設(shè)備及釀造方法逐步實現(xiàn)了現(xiàn)代化醬油年產(chǎn)量約為450萬噸，已居世界首位醋年產(chǎn)量約為250萬噸6酒精二十世紀初期，外商在東北設(shè)立和兩個酒精廠1922年溥益酒精廠成立，為第一個由國人設(shè)立的酒精廠1934年華僑投資在浦東設(shè)立中國酒精廠，當時號稱遠東第一大型酒精廠酒精

18、年產(chǎn)量解放前僅1萬噸左右。7酶制劑1964年才在建立了第一個酶制劑工廠目前有酶制劑生產(chǎn)廠家40家左右，其中萬噸以上，銷售額2000萬以上有8家，其余均在萬噸以下目前的年產(chǎn)量為22萬噸左右8檸檬酸1953年我國曾進展淺盤發(fā)酵制檸檬酸的中型生產(chǎn)1965年前后由酵母廠首先采用深層發(fā)酵法，由薯干直接發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸生產(chǎn)能力為35萬t/a，實際產(chǎn)量達25萬t/a左右，出口量居世界第一位9.微生物制藥在建立了第一個抗生素工廠(即后來的第三制藥廠)，以生產(chǎn)青霉素為主1958年我國最大的抗生素工廠華北制藥廠亦正式投入生產(chǎn)10味精1964年我國谷氨酸發(fā)酵研究成功，首先在投入生產(chǎn)味精生產(chǎn)萬噸以上產(chǎn)量的工廠有17家最

19、大規(guī)模是蓮花味精集團公司，年產(chǎn)12萬噸目前年產(chǎn)量60多萬噸11基因工程產(chǎn)品至1998年，已有14種基因工程藥物、3個基因工程疫苗和數(shù)十個重組診斷試劑投放市場12細胞工程產(chǎn)品紫草、三七等等植物細胞已可在發(fā)酵罐種大規(guī)模培養(yǎng)。我國的傳統(tǒng)中藥涉及5000種左右植物，細胞培養(yǎng)是中藥資源開發(fā)的一個重要方面。七我國發(fā)酵工業(yè)的主要進步1.發(fā)酵產(chǎn)品增長快、質(zhì)量明顯提高，在國民經(jīng)濟中起重要作用新型發(fā)酵工業(yè)：年產(chǎn)量115萬噸；產(chǎn)值150億；利稅50億。釀酒工業(yè)不包括酒精：年產(chǎn)量2000萬噸左右；產(chǎn)值450億；利稅120億。2.科技進步，技術(shù)水平提高例如：糖化酶的發(fā)酵液酶活力由7000 uml提高至30000-400

20、00 uml；味精和檸檬酸三個主要指標：產(chǎn)酸率、轉(zhuǎn)化率和提取率提高5%左右。3.積極開發(fā)新產(chǎn)品特鮮味精；無水檸檬酸、檸檬酸鹽；高溫-淀粉酶；纖維素酶； -葡聚糖酶；異淀粉酶等酶制劑；L一蘋果酸；L一乳酸；衣康酸；黃原膠;功能性發(fā)酵制品: r-亞麻酸；冬蟲夏草；蘑菇、靈芝多糖; 活性肽；紅曲色素, 低聚異麥芽糖、果糖、半乳糖、木糖；海藻糖等等。八與國際先進水平的差距1多數(shù)工廠規(guī)模小、效益低2生產(chǎn)技術(shù)水平比擬低3產(chǎn)品品種單一，構(gòu)造不合理4應(yīng)用的深度和廣度不夠5技術(shù)裝備和檢測手段落后，自動化水平低6綜合利用和環(huán)境治理差九、參加WTO對我國發(fā)酵行業(yè)的影響1有利因素主要表現(xiàn)我國參加WTO后，是世貿(mào)組織的

21、一個成員，可以同等享受最惠國待遇國民待遇也是世貿(mào)組織的一個重要原則參加世貿(mào)組織，對企業(yè)引進外資和先進技術(shù)和先進裝備以及管理經(jīng)歷，加速企業(yè)改組改造，進展企業(yè)構(gòu)造和產(chǎn)品構(gòu)造調(diào)整，促進企業(yè)的進一步開展有利中國參加WTO后，關(guān)稅進一步降低中國參加WTO后，發(fā)酵企業(yè)對原料的選擇性圍寬了2不利因素主要表現(xiàn)：對原料產(chǎn)區(qū)形成賣糧難國外先進國家技術(shù)水平高，產(chǎn)品質(zhì)量好、本錢低，對國同類產(chǎn)品沖擊較大我國研究力量薄弱，研究手段相對落后，綜合素質(zhì)較差3應(yīng)對措施：加快技術(shù)進步步伐，走創(chuàng)新之路，提高水平，降低本錢調(diào)整企業(yè)構(gòu)造和產(chǎn)品構(gòu)造提高企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)經(jīng)營管理水平，加強產(chǎn)品質(zhì)量管理和產(chǎn)品標準化工作加強國國際之間的技術(shù)交流和合作，

22、引進入才、引進外資、引進先進技術(shù)和裝備發(fā)揮各行業(yè)的優(yōu)勢和特點，摘出本企業(yè)有特色的產(chǎn)品，以提高競爭力發(fā)酵工程的重大轉(zhuǎn)折點二十世紀四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。1928年由 Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素1941年美國和英國合作對青霉素進展生產(chǎn)研究外表培養(yǎng)：1升扁瓶或錐形瓶，裝200mL麥麩培養(yǎng)基 40u/ml1943年沉浸培養(yǎng)： 5m3 200u/ml當今：100m3200m3 5-7萬u/ml鏈霉素、金霉素、新霉索、紅霉素大型發(fā)酵罐攪拌裝置180M3發(fā)酵罐車間發(fā)酵車間的空氣過濾器現(xiàn)代生物技術(shù)分子生物學與發(fā)酵工程氨基酸發(fā)酵工業(yè)谷氨酸、賴氨酸核酸發(fā)酵工業(yè)肌苷酸、烏

23、苷酸微生物變異株通過代調(diào)節(jié)代控制發(fā)酵技術(shù)切斷支路代轉(zhuǎn)折點: 酶的活力調(diào)控, 酶的合成調(diào)控(反響控制和反響阻遏) 解除菌體自身的反響調(diào)節(jié),特殊調(diào)節(jié)控制的利用,突變株的應(yīng)用,前體、終產(chǎn)物、副產(chǎn)物等發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化開展目前，全球發(fā)酵產(chǎn)品的年銷售額在400億美元左右，并以每年約78的速率增長。我國發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)有5000多家，主要發(fā)酵產(chǎn)品的年產(chǎn)值高達1300億元。發(fā)酵工程技術(shù)給人類社會生產(chǎn)力的開展帶來了巨大的潛力21世紀是生物技術(shù)世紀未來學家說：21世紀是生物技術(shù)世紀；科學家預(yù)言： 21世紀世界即將在生物技術(shù)上取得重大突破，新世紀之初，科學方面的主要將在生物學、遺傳學和醫(yī)學、新型生物材料、能源、環(huán)境保

24、護上有所突破；經(jīng)濟學家則認為：21世紀20年代，生物經(jīng)濟將由目前的形成階段進入成長階段，即工業(yè)生產(chǎn)與商業(yè)開發(fā)階段。1.3 發(fā)酵工程的生物學與工程學根底發(fā)酵工程的主要問題-過程優(yōu)化與放大在已提供高產(chǎn)菌株的根底上，如何把這些高產(chǎn)菌種在培養(yǎng)過程中進一步考察它的生理生化特性，穩(wěn)定或改進微生物反響工藝過程，這里要求對生物物性的動態(tài)有詳盡的了解，對生化反響做定量的和動力學方面的考察。發(fā)酵工程在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)開展中的地位21世紀的工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，終究是一個什么樣的格局？作為工業(yè)生物技術(shù)核心的發(fā)酵工程，在已經(jīng)開場的生物經(jīng)濟時代，是處于一種什么狀態(tài)？能起何種作用？又面臨那些課題？這是人們所關(guān)注的問題！1 .4

25、本課程的學習容通過發(fā)酵工程的學習，將技術(shù)根底課和專業(yè)課與發(fā)酵工業(yè)的操作原理結(jié)合起來，了解發(fā)酵工業(yè)控制的特性及共性，并且熟悉發(fā)酵工業(yè)的工藝流程及常用術(shù)語，為今后從事生物工程的有關(guān)科研和生產(chǎn)打下良好的根底。第二章菌種的來源及選育第一節(jié)微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一.微生物的特性二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征1.細菌Bacterium) 1形態(tài)2構(gòu)造3培養(yǎng)特征2.酵母Yeast) 1形態(tài)2構(gòu)造典型構(gòu)造:細胞壁；細胞膜；細胞核；液泡；線粒體；質(zhì)網(wǎng)；核糖體；微體；微絲；含物3.霉菌形態(tài)4、微生物的特點體積?。环N類多；分布廣；繁殖快；便于培養(yǎng)；容易發(fā)生變異；在生產(chǎn)中不易受時間、季節(jié)、地區(qū)的限制5、微生

26、物與發(fā)酵發(fā)酵工程是以微生物的生命活動為中心的微生物的生物學性狀和發(fā)酵條件決定了其相應(yīng)產(chǎn)物的生成工業(yè)上用的全部微生物都稱為工業(yè)微生物，工業(yè)生產(chǎn)上常用的微生物主要是細菌、放線菌、酵母菌和霉菌由于發(fā)酵工程本身的開展以及基因工程正在進入發(fā)酵過程，病毒、藻類等其它微生物也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)菌。三工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強遺傳性能要相對穩(wěn)定不易感染它種微生物或噬菌體產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮在分類學上最好與致病菌無關(guān)生產(chǎn)特性要符合工藝要求第二節(jié) 自然界中有目的微生物別離的原則一、菌種別離的一般過程二

27、、采樣時要注意的問題三、目的微生物富集的一些根本方法四、菌落的選出第三節(jié) 已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物第四節(jié) 優(yōu)良菌種選育一、自然選育二、誘變育種誘變育種的一般步驟 出發(fā)菌株 純化、活化、前培養(yǎng)同步培養(yǎng) 培養(yǎng)液 離心收集細胞、洗滌，制備均一的菌懸液玻璃珠打散、過濾 單細胞或單孢子懸液 活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗 誘變處理 活細胞計數(shù)，致死率計算 后培養(yǎng)中間培養(yǎng) 平板別離 變異率計算 初篩復(fù)篩 保藏及擴大試驗誘變育種工作中應(yīng)注意的問題1.平安問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操作中應(yīng)時刻注意平安問題：個人平安和環(huán)境平

28、安。 個人平安：操作時注意防護，不同誘變劑要求不同防護方法，如-射線輻射防護要求較高，uv要求較低，而化學誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸。 環(huán)境平安：所用物品要經(jīng)解毒處理；液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放。2. 要養(yǎng)成良好的工作習慣：如仔細觀察細微的形態(tài)變化、要詳實記錄菌株的誘變史和誘變譜系。 3. 誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合。 4. 誘變育種由于其篩選的盲目性，突變的不定向性，工作量十分大，因此要對整個工作進展合理的設(shè)計并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率。 第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型是一種生化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。遺傳信息的載體是一系列為酶蛋白編碼的核酸序列，如

29、果核酸序列中的*堿基發(fā)生突變，由該基因所控制的酶合成受阻，該菌株也因此不能合成*種營養(yǎng)因子，使正常代失去平衡。在篩選營養(yǎng)缺陷型菌株中，與之有關(guān)的培養(yǎng)基有三類：完全培養(yǎng)基：plete Medium CM含有滿足*微生物的所有營養(yǎng)缺陷型和野生型菌株生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的天然或半合成培養(yǎng)基。 根本培養(yǎng)基：Minimal MediumMM：不含生長因子僅能滿足*微生物的野生型菌株生長需要的最低成分合成培養(yǎng)基。 補充培養(yǎng)基：Supplemented Medium(SM)：補充了一種或數(shù)種生長因子，以滿足*微生物的特定的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，其中的生長因子多是通過直接添加AA、堿基或維生素而提供。第三章菌種

30、保藏的原理和方法一原理使微生物的代處于最不活潑或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、枯燥、寡營養(yǎng)和隔絕空氣二防止菌種衰退的方法控制傳代次數(shù)選擇適宜的培養(yǎng)條件利用不同類型的細胞進展傳代選擇適宜的保藏方法三菌種保藏法斜面保藏法(傳代培養(yǎng)保藏法 )是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于46進展保存并間隔一定時間進展移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。液體石蠟保藏法(礦物油保藏法 )是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出強健菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫46枯燥處進展保存的一種菌種保藏方法。穿刺保藏法1

31、%軟瓊脂小試管和螺口小管沙土管保藏法將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液，注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置枯燥器中于46或室溫進展保存的一種菌種保藏方法。真空冷凍枯燥保藏法將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停頓，從而長期維持存活狀態(tài)。液氮超低溫保藏液氮超低溫保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196的液態(tài)氮，或在-150的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新代趨于停頓而有效地保藏微生物。-20低溫冷凍保藏將菌種保藏在-20冰箱中以減緩細胞的生理活

32、動進展冷凍的一種保藏方法。四菌種保藏機構(gòu)CCGMC: AS-1,2,3,4,IVACCC: ISFCICC: IFFICMCC: NICPBP,ID,IVCACC第四章微生物的代調(diào)節(jié)與代工程第一節(jié) 代調(diào)節(jié)的方式1，細胞透性的調(diào)節(jié)細胞質(zhì)膜的透性直接影響物質(zhì)的吸收和代產(chǎn)物的分泌，從而影響到細胞代的變化。細胞質(zhì)膜的透性的調(diào)節(jié)是微生物代調(diào)節(jié)的重要方式，由它控制著營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。2，代途徑區(qū)域化 原核微生物細胞構(gòu)造雖然簡單，但也劃分出不同的區(qū)域，對于*一代途徑有關(guān)的酶系則集中在*一區(qū)域，以保證這一代途徑的酶促反響順利進展，防止了其他途徑的干擾。例如呼吸的酶系集中在細胞質(zhì)膜上；而與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的酶系則位

33、于核蛋白體上；分解大分子的水解酶，在革蘭氏陰性菌里是位于壁膜間隙中，而革蘭氏陽性菌則將這些水解酶類，分泌于胞外。在真核微生物細胞里，各種酶系被細胞器隔離分布。如與呼吸產(chǎn)能有關(guān)的酶系集中于線粒體膜上；蛋白質(zhì)的合成酶系位于核蛋白體上；DNA合成的*些酶位于細胞核里。細胞具有復(fù)雜的構(gòu)造使其代活動只能在特定的部位上進展，即代活動是區(qū)域化的，其實質(zhì)是控制酶與底物接觸，使各個反響有序地進展。3，代流向的調(diào)控微生物在不同條件下可以通過控制各代途徑中*個酶促反響的速率來控制代物的流向，從而保持機體代的平衡。它包括兩種形式:由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反響由兩種酶控制的逆單向反響由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反響: 同一個酶

34、可以通過不同輔基(或輔酶)控制代物的流向。例如，谷氨酸脫氫酶以NADP+為輔酶時，主要是催化谷氨酸的合成，當以NAD+為輔酶時，則催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通過不同的輔基來控制代物的流向。由兩種酶控制的逆單向反響: 逆單向反響是在生物體代的關(guān)鍵部位的*些反響，它是由兩種各自不同的酶來催化的。即在一個可逆反響中，其中一種酶催化正反響，而另一種酶則催化逆反響。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反響則是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反響則由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。4，代速度的調(diào)控在不可逆反響中，微生物通過調(diào)

35、節(jié)酶的活性和酶量來控制代物的流量。微生物在不同條件下能按照需要，通過激活或抑制原有酶的活性或通過誘導(dǎo)或阻遏酶的合成來自我調(diào)節(jié)其代速度，使之高度經(jīng)濟有效地利用能量和原料進展生長繁殖。二、酶活性的調(diào)節(jié)1. 概念酶活性調(diào)節(jié)是指一定數(shù)量的酶，通過其分子構(gòu)象或分子構(gòu)造的改變來調(diào)節(jié)其催化反響的速率。2. 酶活性調(diào)節(jié)的影響因素底物和產(chǎn)物的性質(zhì)和濃度環(huán)境因子(如壓力、pH、離子強度和輔助因子等)其他酶的存在3 .酶活性調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)方式 激活已有酶的活性- 激活劑 抑制已有酶的活性- 抑制劑 4 .酶活性的調(diào)節(jié)機制 改變酶分子的活性來調(diào)節(jié)微生物代速度的方法稱為酶活性的調(diào)節(jié)。其活性發(fā)生改變的酶稱為調(diào)節(jié)酶Regula

36、tory enzyme。調(diào)節(jié)酶也稱關(guān)鍵酶，包括變構(gòu)酶、同功酶和多功能酶，通常為變構(gòu)酶，一般具有多個亞基，包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。微生物體代過程的各種生物化學反響，都是由各種酶來催化的。按各種酶在代調(diào)節(jié)中作用的不同，又可將酶分為：調(diào)節(jié)酶(常稱關(guān)鍵酶，與代調(diào)節(jié)關(guān)系密切)：包括以下3種： 1)變構(gòu)酶：一般是具有多亞基四級構(gòu)造的蛋白質(zhì)。 2)同功酶：具有同一種酶的底物專一性，但分子構(gòu)造不同的一類酶。 3)多功能酶：能夠催化兩種以上不同反響的酶。靜態(tài)酶：一般與代調(diào)節(jié)關(guān)系不大。 潛在酶：指酶原、非活性型或與抑制劑結(jié)合的酶。 一激活激活：在激活劑的作用下，使原來無活性的酶變成有活性，或使原來活性低的酶提高了

37、活性的現(xiàn)象。代調(diào)節(jié)的激活作用：主要是指代物對酶的激活。前體激活，指代途徑中后面的酶促反響，可被該途徑中較前面的一個中間產(chǎn)物所促進。代中間產(chǎn)物的反響激活，指代中間產(chǎn)物對該代途徑的前面的酶起激活作用。二抑制抑制：由于*些物質(zhì)的存在，降低酶活性的現(xiàn)象。反響抑制：反響抑制是指代的末端產(chǎn)物對酶(往往是代途徑中的第一個酶)活性的抑制。1，無分支代途徑的調(diào)節(jié)通常是在線形的代途徑中末端產(chǎn)物對催化第一步反響的酶活性有抑制作用。2，有分支代途徑的調(diào)節(jié)在有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支合成代途徑中，調(diào)節(jié)方式較復(fù)雜，其共同特點是每個分支途徑的末端產(chǎn)物控制分支點后的第一個酶，同時每個末端產(chǎn)物又對整個途徑的第一個酶有局部

38、的抑制作用，分支代的反響調(diào)節(jié)方式有多種:酶的順序反響抑制同工酶的反響抑制協(xié)同反響抑制累積反響抑制超相加反響抑制1酶的順序反響抑制分支代途徑中的兩個末端產(chǎn)物，不能直接抑制途徑中的第一個酶，只有當兩個末端產(chǎn)物都過量時，才能對途徑中的第一個酶有抑制作用。2同工酶的反響抑制同功酶是指能催化同一生化反響，但它們的構(gòu)造稍有不同，可分別被相應(yīng)的末端產(chǎn)物抑制的一類酶。其特點是：途徑中第一個反響被兩個不同的酶所催化，一個酶被Y抑制，另一個酶被Z抑制。只有當Y和Z同時過量才能完全阻止A轉(zhuǎn)變?yōu)锽。3協(xié)同反響抑制在分支代系統(tǒng)中，幾種末端產(chǎn)物同時都過量，才對途徑中的第一個酶具有抑制作用，如果末端產(chǎn)物單獨過量則對途徑中的

39、第一個酶無抑制作用。4累積反響抑制在分支代途徑中各種末端產(chǎn)物單獨過量時，它們各自能對途徑中的第一個反響的酶僅產(chǎn)生較小的抑制作用。一種末端產(chǎn)物單獨過量并不影響其它末端產(chǎn)物的形成，只有當幾種末端產(chǎn)物同時過量時，才對途徑中的第一個酶產(chǎn)生較大的抑制。5超相加反響抑制超相加反響抑制是一種既不同于協(xié)同反響抑制又不同于累積反響抑制的作用。對一個分支代途徑中，幾種末端產(chǎn)物單獨過量時，僅產(chǎn)生對共同途徑的第一個酶局部的抑制。如果每種末端產(chǎn)物都過量時，其抑制作用則超過各種末端產(chǎn)物單獨過量時抑制的總和。 5，酶活性調(diào)節(jié)的分子機制解釋酶活性調(diào)節(jié)機制的理論：別構(gòu)調(diào)節(jié)理論(其核心是酶分子構(gòu)象的改變)酶分子的化學修飾理論(其

40、核心是酶分子構(gòu)造的改變)。三、酶合成的調(diào)節(jié)1.酶合成的誘導(dǎo)： 促進酶的合成.2.酶合成的阻遏： 抑制酶的合成. 包括：1)終產(chǎn)物阻遏。 2)分解代物阻遏。1.酶合成的誘導(dǎo)1).誘導(dǎo)酶:當環(huán)境中存在誘導(dǎo)劑時才產(chǎn)生的酶。而這種環(huán)境物質(zhì)促使微生物細胞中酶合成的現(xiàn)象稱為酶的誘導(dǎo)。2).組成酶:(p26)-EMP2，酶合成誘導(dǎo)的機制誘導(dǎo)機制: 操縱子學說可以較好的說明酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生的機制，操縱子指一組功能上相關(guān)的基因，它們由啟動基因、操縱基因和構(gòu)造基因構(gòu)成。3，酶合成的阻遏1). 末端代產(chǎn)物阻遏End-product repression 這是酶合成阻遏中的一種。它是指由于末端產(chǎn)物的過量積累而引起代途徑中

41、酶合成的阻遏，是一種反響阻遏，末端代產(chǎn)物阻遏的特點是同時阻遏合成途徑中所有酶的合成。對于分支代途徑的末端代產(chǎn)物阻遏，每種末端產(chǎn)物只專一地阻遏合成它自身那條分支途徑的酶，而分支點的酶則受所有分支途徑末端產(chǎn)物的共同阻遏。這種幾個終產(chǎn)物，共同協(xié)調(diào)阻遏*一個酶的生物合成稱為多價阻遏multivalent repression。對于直線式代途徑，末端產(chǎn)物阻遏情況較為簡單。末端產(chǎn)物將引起代途徑中各種酶的合成終止。末端代產(chǎn)物阻遏的機制可以用操縱子學說解釋。如大腸桿菌色氨酸操縱子模型。2). 酶合成的分解代物阻遏Catabolite repression 所謂分解代阻遏，是當細胞中具有一優(yōu)先利用的底物時，很多

42、其他分解反響途徑往往受到最容易利用的底物阻遏的現(xiàn)象。由于這種阻遏并不是優(yōu)先利用底物及作用的結(jié)果，而是有底物分解過程中產(chǎn)生的中間代物引起的，所以稱為分解代物阻遏。這種阻遏效應(yīng)最早在1942年由Monod在研究大腸桿菌混合碳源生長時發(fā)現(xiàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在微生物的生長體系中，外加CAMP環(huán)腺苷酸可解除分解代物阻遏，這說明分解代物阻遏的實質(zhì)是由于細胞缺少CAMP。分解代物阻遏作用是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上的，因而屬于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。Monod提出的乳糖操縱子模型可以較好地解釋分解代物的阻遏機制。葡萄糖效應(yīng) 又稱葡萄糖阻遏或分解代產(chǎn)生阻遏作用。 葡萄糖或*些容易利用的碳源，其分解代產(chǎn)物阻遏*些誘導(dǎo)酶體系編碼的基因

43、轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象。如大腸埃希氏菌培養(yǎng)在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，在葡萄糖沒有被利用完之前，乳糖操縱子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，這是因為葡萄糖的分解物引起細胞cAMP環(huán)腺苷酸含量降低，啟動子釋放cAMP-CAP蛋白，RNA聚合酶不能與乳糖的啟動基因結(jié)合，以至轉(zhuǎn)錄不能發(fā)生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操縱子才進展轉(zhuǎn)錄，形成利用乳糖的酶，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)。CAP： 降解物激活蛋白 又叫分解代基因活化蛋白catabolite activator protein，簡稱CAP 。在分解代阻遏中調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是降解物基因活化蛋白CAP，它能與 環(huán)腺苷酸cAMP結(jié)合而被活化，幫助RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，促進

44、轉(zhuǎn)錄進展。 4，酶合成阻遏的機制四、能荷調(diào)節(jié)能荷:指細胞中ATP,ADP,AMP系統(tǒng)中可為代反響供能的高能磷酸鍵的量度。能荷=(【ATP】+0.5 【ADP】) (【ATP】+ 【ADP】+ 【AMP】) 100能荷= 100全部是ATP能荷= 0全部是AMP能荷= 50全部是ADP (三)、次級代的調(diào)節(jié)初級代對次級代的調(diào)節(jié)碳代物的調(diào)節(jié)作用氮代物的調(diào)節(jié)作用磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用次級代中的誘導(dǎo)作用及產(chǎn)物的反響作用次級代中細胞膜透性調(diào)節(jié)(四)、次級代物合成的特點次級代物合成過程遠較初級代產(chǎn)物復(fù)雜；次級代產(chǎn)物則需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件；在分批培養(yǎng)條件下，次級代產(chǎn)物一般都是在菌體生長的峰值出現(xiàn)后才大量合成。 (五

45、)、常用的提高次級代產(chǎn)物產(chǎn)量的方法 (1) 補加前體類似物 前體：指*些化合物參加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的構(gòu)造并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因參加前體而有較大的提高。在合成途徑已根本清楚的條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加前體是增加次級產(chǎn)物的有效方法。如青霉素G的生產(chǎn)中，苯乙酰-CoA是限速性因子，補加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的產(chǎn)量。 次級代產(chǎn)物形成中并不是所有前體類似物都是限制性因子。參加前體提高產(chǎn)量的效果更取決于總體代的調(diào)節(jié)水平。前體物質(zhì)本身是否易于得到等。這都是在生產(chǎn)應(yīng)用中需綜合考慮的。 (2) 參加誘導(dǎo)物把一些對次級代產(chǎn)物產(chǎn)生有誘

46、導(dǎo)作用的物質(zhì)參加發(fā)酵培養(yǎng)基中會增加產(chǎn)量。如加蛋氨酸或硫脲可使頂頭孢霉增產(chǎn)頭孢霉素C，參加巴比妥可提高利福霉素產(chǎn)量等。但在工業(yè)生產(chǎn)中還未普遍應(yīng)用此技術(shù)，而只是在選擇培養(yǎng)基組成時給以考慮。 目前工業(yè)用微生物酶多數(shù)為誘導(dǎo)酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。誘導(dǎo)物的存在能大大強化誘導(dǎo)酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類似物都可作為誘導(dǎo)物。(3) 防止碳分解代阻遏或抑制的發(fā)生青霉素發(fā)酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以減少碳分解阻遏的發(fā)生，是一項很有效的提高產(chǎn)量的方法。 使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。參加影響糖代的硫氰酸芐酯

47、可使金霉菌對葡萄糖的利用速度減緩，可增加金霉素的產(chǎn)量。(4) 防止氮代阻遏的發(fā)生防止使用高濃度的銨鹽做氮源以防止氮代阻遏的發(fā)生，是抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中比擬成熟的經(jīng)歷。在抗生素產(chǎn)生期如補加氮源則會造成發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，返回生長期，抗生素的產(chǎn)量會大為減少。使用亞適量(對菌體生長)的磷酸鹽，亦是抗生素發(fā)酵工業(yè)中遵循的原則之一。 為防止碳、氮、磷分解阻遏的發(fā)生，應(yīng)選用黃豆餅粉、蛋白胨類、淀粉類物質(zhì)為主要原料，而盡量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 (5) 篩選耐前體或前體類似物的突變株參加前體有提高次級產(chǎn)物產(chǎn)量的效果；但過量對菌體又會有毒。篩選對前體有抗性的突變株以減少或消除前體的反響阻遏，從而可獲得高產(chǎn)。如抗苯

48、乙酸的青霉突變株，其青霉素的產(chǎn)量會增加。半胱氨酸、纈氨酸是-酰胺類抗生素的前體，篩選上述氨基酸的類似物，三氟亮氨酸、DL纈氨酸的抗性菌株，其-酰胺類抗生索產(chǎn)量會提高。(6) 選育抗抗生素突變株鏈霉素、氯霉素、金霉素籌多種抗生素都具有抑制產(chǎn)生自身菌體蛋白質(zhì)的能力。一株高產(chǎn)抗生索產(chǎn)生菌，必然應(yīng)具備對自身所分泌的抗生索的抗性。篩選抗抗生素產(chǎn)生菌也就成了菌種選育中的常用方法。金霉素、鏈霉素產(chǎn)生菌的抗性菌株產(chǎn)量有數(shù)倍增加的實驗室結(jié)果已有不少報道。 (7) 篩選營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株次級代產(chǎn)物都來自初級代產(chǎn)物，因此其營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)量一般都很低，但其回復(fù)突變型中卻有不少獲得高產(chǎn)的例子，其機制尚不清楚，估計是

49、次生產(chǎn)物或其前體合成的反響抑制被解除。在金霉素產(chǎn)生菌選育中，運用此方法曾獲得高產(chǎn)菌株。 (8) 抗毒性突變株的選育重金屬離子、羥胺類物質(zhì)對-酰胺類抗生素產(chǎn)生菌有毒，但與抗生素相結(jié)合可解毒。選擇適當濃度的此類毒性物質(zhì)使其恰好抑制產(chǎn)生菌生長，在此條件下能生長的菌株，應(yīng)為抗生素類物質(zhì)過量產(chǎn)生的突變株。曾由頭孢霉素C對重金屬離子的抗性突變株中選育到高產(chǎn)菌株。 有些種類的發(fā)酵生產(chǎn)對金屬離子相當敏感，因為有些金屬離子是中間代酶的抑制劑或激活劑。因此對于有重大影響的金屬離子必須嚴格控制。如檸檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子都能明顯影響產(chǎn)量，鈣離子對細菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進作用，而鈷離子對葡萄糖異構(gòu)酶的發(fā)酵是必需的，這

50、些在培養(yǎng)基配制時都必須予以注意。小結(jié)：以上主要是從微生物的代調(diào)節(jié)機制出發(fā)探討獲得代產(chǎn)物過量生產(chǎn)的方法。但是，微生物代產(chǎn)物特別是次級產(chǎn)物形成的途徑和調(diào)節(jié)控制機制是相當復(fù)雜的，研究得比擬清楚的只是少數(shù)。因此，上述方法的應(yīng)用往往也是經(jīng)歷性的。 在生產(chǎn)實踐中為提高微生物產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)經(jīng)常使用的方法是誘變后隨機篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化。近年來運用遺傳工程的方法以獲得代產(chǎn)物的過量生產(chǎn)是很活潑的研究領(lǐng)域。第五章培養(yǎng)基培養(yǎng)基medium是人工配制的,適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。無論是以微生物為材料的研究,還是利用微生物生產(chǎn)生物制品,都必須進展培養(yǎng)基的配制，它是微生物學研究和微生物發(fā)酵工業(yè)的根底。一、

51、 配制培養(yǎng)基的原則1. 選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)總體而言,所有微生物生長繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水及能源,但由于微生物營養(yǎng)類型復(fù)雜,不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需不一樣的,因此首先要根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需求配制針對性強的培養(yǎng)基。自養(yǎng)型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸、維生素等復(fù)雜的有機物,因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以(或應(yīng)該)由簡單的無機物組成。例如,培養(yǎng)化能自養(yǎng)型的氧化硫硫桿菌(Thiobacillus thioo*idans)的培養(yǎng)基組成見表4-10。在該培養(yǎng)基配制過程中并未專門參加其他碳源物質(zhì),而是依靠空氣中和溶于水中的CO2為氧化硫硫桿菌

52、提供碳源。表4-10 幾種類型培養(yǎng)基組成成份氧化硫硫桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 高氏一號合成培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基 主要作用牛肉膏5 碳源能源、氮源、 無機鹽、生長因子蛋白胨1010 氮源、碳源能源、生長因子酵母浸膏5 生長因子、氮源、碳源能源葡萄糖5 碳源能源蔗糖30碳源能源可溶性淀粉20碳源能源CO2來自空氣碳源 NH42SO4 0.4 氮源、無機鹽NH4H2PO41氮源、無機鹽 KNO31氮源、無機鹽 NaNO3 3 氮源、無機鹽MgSO47H2O0.50.2 0.50.5無機鹽FeSO40.010.010.01無機鹽KH2PO44 無機鹽K2HPO410.51

53、 無機鹽NaCl 5 5 0.5 10無機鹽KCl0.5 無機鹽CaCl2 0.25 無機鹽S 10能源 H2O100010001000100010001000溶劑pH 7.0 自然7.0 滅菌條件12120分11230分12120分12120分12120分12120分*表中培養(yǎng)基各組份含量均為每升培養(yǎng)基中該成份的克數(shù)。培養(yǎng)其他化能自養(yǎng)型微生物與上述培養(yǎng)基成分根本類似,只是能源物質(zhì)有所改變。對光能自養(yǎng)型微生物而言,除需要各類營養(yǎng)物質(zhì)外,還需光照提供能源。培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物需要在培養(yǎng)基中添加有機物,而且不同類型異養(yǎng)型微生物的營養(yǎng)要求差異很大,因此其培養(yǎng)基組成也相差很遠。例如,培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組

54、成比擬簡單(表4-10),而有些異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的成份非常復(fù)雜,如腸膜明串珠菌需要生長因子,假設(shè)配制培養(yǎng)它的合成培養(yǎng)基時,需要在培養(yǎng)基中添加的生長因子多達33種,因此通常采用天然有機物來為它提供生長所需的生長因子。就微生物主要類型而言,有細菌、放線菌、酵母菌、霉菌、原生動物、藻類及病毒之分,培養(yǎng)它們所需的培養(yǎng)基各不一樣。在實驗室中常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌(表4-10);用高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌(表4-10);培養(yǎng)酵母菌一般用麥芽汁培養(yǎng)基,它是將麥芽粉與4倍水混勻,在5865條件下保溫34小時至完全糖化,調(diào)整糖液濃度為10巴林, 煮沸后用紗布過濾,調(diào)pH為6.

55、0配制而成。麥芽粉組成復(fù)雜,能為酵母菌提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì);培養(yǎng)霉菌則一般用查氏合成培養(yǎng)基(表4-10)。原生動物也可用培養(yǎng)基培養(yǎng),有的原生動物需要較多的營養(yǎng)物質(zhì),例如梨型四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)的培養(yǎng)基含有10種氨基酸、7種維生素、鳥嘌呤、尿嘧啶及一些無機鹽等,而有些變形蟲可在較簡單的蛋白胨肉湯(peptone broth)中生長。大多數(shù)藻類可以利用光能,只需要CO2、水和一些無機鹽就可生長,而*些藻類如眼蟲藻(Euglena)中的一些種可在黑暗條件下利用有機物質(zhì)生長。有些藻類需要在培養(yǎng)基中補加土壤浸液,培養(yǎng)海洋藻類時可直接利用海水,但如果在特殊情況下需要用合成培

56、養(yǎng)基培養(yǎng)海洋藻類時,則必需在培養(yǎng)基中參加海水中含有的各種鹽。2.營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比適宜培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度適宜時微生物才能生長良好,營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需,濃度過高時則可能對微生物生長起抑制作用,例如高濃度糖類物質(zhì)、無機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進微生物的生長,反而起到抑制或殺菌作用。另外，培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和(或)代產(chǎn)物的形成和積累,其中碳氮比(C/N)的影響較大。嚴格地講，碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的摩爾數(shù)比值,有時也指培養(yǎng)基中復(fù)原糖與粗蛋白之比。例如，在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過程中,培養(yǎng)基碳氮比為4/1時,菌體大

57、量繁殖,谷氨酸積累少;當培養(yǎng)基碳氮比為3/1時,菌體繁殖受到抑制,谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。再如,在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)過程中,可以通過控制培養(yǎng)基中速效氮(或碳)源與遲效氮(或碳)源之間的比例來控制菌體生長與抗生素的合成。3.控制pH條件培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的圍,以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代產(chǎn)物。各類微生物生長繁殖或產(chǎn)生代產(chǎn)物的最適pH條件各不一樣,一般來講,細菌與放線菌適于在pH77.5圍生長,酵母菌和霉菌通常在pH4.56圍生長。值得注意的是,在微生物生長繁殖和代過程中,由于營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代產(chǎn)物的形成與積累,會導(dǎo)致培養(yǎng)基pH發(fā)生變化,假設(shè)不對培養(yǎng)基pH條件進展控制,往往導(dǎo)致微生

58、物生長速度或(和)代產(chǎn)物產(chǎn)量降低。因此,為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定,通常在培養(yǎng)基中參加pH緩沖劑,常用的緩沖劑是一氫和二氫磷酸鹽(如K2HPO4和KH2PO4)組成的混合物。K2HPO4溶液呈堿性,KH2PO4溶液呈酸性,兩種物質(zhì)的等克分子混合溶液的pH值為6.8。當培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)積累導(dǎo)致H+濃度增加時, H+與弱堿性鹽結(jié)合形成弱酸性化合物,培養(yǎng)基pH不會過度降低;如果培養(yǎng)基中OH-濃度增加, OH-則與弱酸性鹽結(jié)合形成弱堿性化合物,培養(yǎng)基pH也不會過度升高。但K2HPO4/KH2PO4緩沖系統(tǒng)只能在一定的pH圍pH6.47.2起調(diào)節(jié)作用。有些微生物，如乳酸菌能大量產(chǎn)酸,上述緩沖系統(tǒng)就難以

59、起到緩沖作用,此時可在培養(yǎng)基中添加難溶的碳酸鹽(如CaCO3)來進展調(diào)節(jié),CaCO3難溶于水,不會使培養(yǎng)基pH過度升高,但它可以不斷中和微生物產(chǎn)生的酸,同時釋放出CO2,將培養(yǎng)基pH控制在一定圍。在培養(yǎng)基中還存在一些天然的緩沖系統(tǒng),如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)都屬于兩性電解質(zhì),也可起到緩沖劑的作用。4. 控制氧化復(fù)原電位(redo* potential)不同類型微生物生長對氧化復(fù)原電位()的要求不一樣,一般好氧性微生物在值為+0.1伏以上時可正常生長,一般以+0.3+0.4伏為宜,厭氧性微生物只能在值低于+0.1伏條件下生長,兼性厭氧微生物在值為+0.1伏以上時進展好氧呼吸,在+0.1伏以下時進展發(fā)酵

60、。值與氧分壓和pH有關(guān),也受*些微生物代產(chǎn)物的影響。在pH相對穩(wěn)定的條件下,可通過增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓,或參加氧化劑,從而增加值;在培養(yǎng)基中參加抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫糖醇等復(fù)原性物質(zhì)可降低值。5. 原料來源的選擇在配制培養(yǎng)基時應(yīng)盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,培養(yǎng)基用量很大,利用低本錢的原料更表達出其經(jīng)濟價值。例如，在微生物單細胞蛋白的工業(yè)生產(chǎn)過程中,常常利用糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、豆制品工業(yè)廢液及黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等都可作為培養(yǎng)基的原料。再