原位雜交ish實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、原位雜交原位核酸分子雜交技術(shù)簡稱原位雜交 (in situ hybridization)，是用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再使用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，在顯微鏡或電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)定位。原位雜交技術(shù)可分為直接法和間接法兩種。直接法主要用放射性同位素、熒光或酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用抗原標(biāo)記探針，最后通過免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交技術(shù)已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究如組圖,轉(zhuǎn)等臨床,表達(dá)定位等。并也深入到產(chǎn)

2、前,腫瘤和傳染性實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備的領(lǐng)域中。在實(shí)驗(yàn)開始前，需準(zhǔn)備好所需的試劑，如 2、0.5、0.2的 SSC 緩沖液，DAB試劑盒和原位雜交試劑盒（其中包含了蛋白酶 K，預(yù)雜交液，雜交液，封閉液，兔抗地高辛抗體，HRP-抗兔 IgG）本實(shí)驗(yàn)所使用的儀器和耗材有：賽默飛公司提供的 F1 單道移液器、QSP 盒裝吸頭，濕盒，切片缸，溫箱，硅化蓋玻片等本主要通過間接法原位雜交來展開實(shí)驗(yàn)，大體的流程有：樣品玻片，雜交前處理，雜交，雜交后處理以及顯色。樣品玻片細(xì)胞涂片：將 2-3 滴 PBS 重懸的細(xì)胞液滴于涂有多聚賴氨酸的載首先玻片上，培養(yǎng)箱干燥 5min。雜交前處理滴加 1g/ml 的蛋白酶 K 稀釋液，

3、37C的甘氨酸溶液終止消化。細(xì)胞通透 30min 后，滴加 0.1mol/L預(yù)雜交：用吸水紙輕輕吸去多余的液體，滴加 20l 的預(yù)雜交液，蓋上硅化蓋玻片，37C雜交濕盒孵育 30min。用 0.2 SSC 緩沖液室溫洗三次，每次洗滌 5min。擦去周圍多余的液體，滴加 20l 的雜交液，蓋上硅化蓋玻片，將切片置于90C環(huán)境下孵育 10min ，將切片置于盛有 2 SSC 緩沖液的濕盒中，37C孵育過夜。雜交后處理輕輕揭去蓋玻片，42C預(yù)熱的 2 SSC 緩沖液洗 2 次，每次 5min；37C預(yù)熱的 0.5 SSC 緩沖液洗 1 次，每次 15min；0.2 SSC 緩沖液洗 1 次，每次 1

4、5min。滴加封閉液 37C孵育 30min，去除多余的液體。滴加兔抗地高辛 IgG，濕盒 37C孵育 30min。輕輕去除多余的液體，浸泡在 PBS 中 5min。滴加 HRP -抗兔IgG，將切片放入濕盒中 37C顯色孵育 30min。去除多余的液體，滴加新鮮的 DAB 工作液顯色 20min 后，用蒸餾水終止顯色。最后可在顯微鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果分析經(jīng)過 DAB 染色后，實(shí)驗(yàn)組陽性信號(hào)呈棕黃色，位于胞漿中。疑問解答Doctor A，您能再跟講解一下探針的選擇嗎？可以，其實(shí)使用的探針是指標(biāo)記的有放射性或帶有其他標(biāo)記物的單鏈聚核苷酸片段，用于檢驗(yàn)核酸樣品中特定核苷酸序列。選擇探針的最基本原則是

5、有高度的特異性。根據(jù)探針的來源，可分為：組 DNA 探針、cDNA 探針、RNA探針和寡核苷酸探針。每種探針都有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)自己具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇。與此同時(shí)，探針的長度、濃度和標(biāo)記也是選擇探針時(shí)需要考慮的。探針的長度為 50-300 個(gè)核苷酸最佳，同時(shí)在時(shí)也要考慮模板長度。探針過長，不容易進(jìn)入細(xì)胞；過短，特異性不高。探針過長時(shí)可用堿水裂解達(dá)到長度要求。對(duì)探針的標(biāo)記主要利用放射性同位素、酶、熒光素、半抗原或生物素標(biāo)記，其檢測系統(tǒng)也十分完善。放射性同位素靈敏度高，但由于其半衰期短、實(shí)驗(yàn)周期長、標(biāo)記物不穩(wěn)定以及污染環(huán)境等缺陷。用酶標(biāo)記的探針由于分子大、力差以及對(duì)溫度的要求，在組織原位雜交領(lǐng)域運(yùn)用不

6、廣。熒光素標(biāo)記便于檢測，但熒光容易淬滅，雜交后的片子無法長久保持。生物素和半抗原成為探針的首先標(biāo)記物，被用于間接標(biāo)記原位雜交，目前最常用的是地高辛，靈敏度更高。生物素本身是一種半抗原，當(dāng)由于它可與抗生物素蛋白或鏈親和素有更高的親和力，所以在實(shí)際運(yùn)用中多采用酶標(biāo)親和素。雜交反應(yīng)的時(shí)間可能隨著探針濃度的增加而縮短，但在一個(gè)相當(dāng)大的范圍內(nèi)，雜交反應(yīng)應(yīng)在 4-6h 內(nèi)完成，雜交時(shí)間過 24h。反應(yīng)時(shí)間過長，形成的雜交體會(huì)自動(dòng)解鏈，雜交信號(hào)反而會(huì)減少。生物素或地高辛標(biāo)記的探針濃度為 5到 8 微克每毫升，熒光標(biāo)記的探針濃度為 2.5-4g/ml。Doctor A，原位雜交的難度較高，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中需要

7、注意什么呢？的確，這實(shí)驗(yàn)需要注意的細(xì)節(jié)很多。剛才已經(jīng)講解了有關(guān)探針的選擇，選擇合適的探針已經(jīng)成功了一大步。細(xì)胞通透化也是這實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，因?qū)嶒?yàn)樣本不同，選擇的通透液和通透消化的時(shí)間也不同，此時(shí)需要自己摸索最佳的通透條件。此外，要嚴(yán)格控制好雜交的溫度和時(shí)間，探針種類的不同，雜交溫度也略有差異。探針變性后需冰上放置冷卻，以防復(fù)性。在做 RNA 原位雜交時(shí)，要避免 RNA酶的污染。此外，一定要設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)以較好地分析結(jié)果。Doctor A，我之前遇到過非特異性染色，這是怎么一回事呢？Miss Q，這是做原位雜交的常見問題。非特異性染色可能是來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細(xì)胞、顯色系統(tǒng)等。探針特異性不高以及組織細(xì)胞內(nèi)某些成分與顯示系統(tǒng)中的抗體成分非特異結(jié)合也可造成非特異性染色。組織細(xì)胞內(nèi)源性酶是的重要原因 ,目前最常用的酶是過氧化物酶和堿性磷原位雜交中非特異性酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細(xì)胞中,因此用這些酶時(shí)應(yīng)有消除內(nèi)源性酶的相應(yīng)步驟。如過氧化物酶用3%過氧化氫處理5-10min；10%冰醋酸處理組切片10min,或在底物顯色液中加入 1Mm/L 左