143、糖化酶菌種崗位標準操作規(guī)程

1、 糖化酶菌種崗位標準操作規(guī)程（老糖化酶）1、目的：建立糖化酶生產種子崗位操作規(guī)程，使種子工嚴格操作，確保種子質量及無菌。2、適用范圍：適用于種子崗位 。3、責 任 者：種子操作人員。4、正文：1.菌種工藝流程：甘油管淀粉平板察氏平板半干體種子搖瓶種子罐原始菌種先接入淀粉平板察氏平板半干體純化后由半干體接入甘油管.2.培養(yǎng)基制備：2.1 甘油管制備：在 50 或 100ml 三角瓶中配置 50%濃度的甘油乳液，121，0.11Mpa40分鐘滅菌 2次，放無菌室備用，備用期不能超過 10 天。如果已經使用過，在下次使用時仍需滅菌；用玻璃小試管（10100）或塑料小試管洗凈烘干，121，0.11Mp

2、a40 分鐘滅菌2次后備用；糖化酶用半干體做甘油管，即在無菌條件下吸取 1-2ml半干體于小試管內，同時吸取等量備用 50%的甘油于小試管中，塞好膠塞，充分搖勻。此時的甘油濃度為 20%或略高，如果濃度太高不能冷凝，太低細胞容易破碎不能保藏。一般情況放入-80冰箱保藏半年或一年，時間不能太長。2.2淀粉平板的制備：淀粉培養(yǎng)基(淀粉平板)蛋白胨牛肉粉1.0%0.3%1.0%酵母粉NaCL0.2%0.2%玉米淀粉瓊脂粉1.7%稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調 PH到 5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121、30分鐘滅菌，冷卻到 50倒平板，每皿 20-25ml。分離時用移液管吸取 0.1ml-

3、0.2ml半干體種子涂布于培養(yǎng)基中,331， 培養(yǎng) 4-5天. 技術要求:單菌落要多,呈褶皺,盆地狀.2.3察氏平板的制備:蔗糖3%硝酸鈉0.2%0.05%磷酸氫二鉀0.1%MgSO 7H O24 SOP IPC 143 00FeSO 7H O 0.001%第 2頁共 8頁KCL0.05%42瓊脂粉1.7%稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調 PH到 5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121、30分鐘滅菌，冷卻到 50倒平板，每皿 18-20ml。將淀粉平板中典型菌落涂布于培養(yǎng)基中,331 培養(yǎng) 4-5天.技術要求:菌苔厚,無雜菌污染,灰色帶紅2.4半干體培養(yǎng)基蔗糖3%硝酸鈉0.2%磷酸氫二鉀

4、0.1%MgSO .7H O 0.05%24FeSO .7H O 0.001%2KCL0.05%4瓊脂粉0.05%稱量完畢后定容到所需體積，用稀鹽酸調 PH到 5.8-6.1，煮沸使瓊脂溶解，121、30分鐘滅菌，將察氏平板中典型菌苔刮入培養(yǎng)基中,34 培養(yǎng) 4-5天.培養(yǎng)期間每天每 6小時順時針搖 3-4圈。2.5種子搖瓶制備:豆餅粉玉米漿玉米淀粉高淀2%2%12%0.05%豆 粉 單 獨 稱 量 倒 入 瓶 中 ,玉 米 淀 粉 加 熱 煮 沸 液 化 10 分 鐘 ,每 瓶 裝 量150ml/500ml,121、40分鐘滅菌.將半干體在無菌條件下吸入 10-15ml.上搖床,轉速300轉

5、/分鐘,33-34培養(yǎng) 2-3天.3.火焰保護法接種小罐3.1 準備工作，酒精棉球一瓶，鑷子、火柴、噴霧器。3.2 小罐接種：罐溫降至 32時，用 75%酒精棉球消毒接種口及用 5%石碳酸噴霧消毒小罐周圍的空氣，然后在小罐接種口點燃酒精棉滅菌，關閉接種葫蘆靠罐閥 ,擰開接種帽,不要將其拿出火焰保護范圍,將裝有種液的搖瓶在火焰保護下迅速倒入接種葫蘆內,擰上接種帽.打開靠罐閥,調整罐壓使之升到 0.08MPa，再緩慢降至 0.03MPa，反復數(shù)次，利用壓差法將種液接入罐內.4. 無菌試驗4.1 固體、液體細菌培養(yǎng)基的制備方法 SOP IPC 143 00原料名稱第 3頁共 8頁液體配方（%）-0.

6、50.60.5-瓊 脂PH2.02.27.07.27.07.24.2 固體培養(yǎng)基的配制4.2.1 稱取牛肉膏，蛋白胨于燒杯中，加適量水、加熱攪勻溶解后加至需要量水，然后用 10%NaOH調節(jié) PH值(用 PH計測定)。4.2.2 將調好 PH值的固體培養(yǎng)基分裝在三角瓶中(1000ml瓶裝量 200ml) 加瓊脂，包扎好消毒，壓力為 0.100.11MPa溫度 1211， 時間 30分鐘。4.2.3 消毒后的固體培養(yǎng)基自然冷卻至 50左右在無菌條件下倒碟，每支雙碟裝量 2025 ml不易太厚或太薄，凝固移入恒溫室培養(yǎng) 24-48小時， 檢查無菌方可使用。5 取無菌樣5.1 種子罐每隔 8小時取無

7、菌樣一次，劃無菌平板 2個。大罐每 8小時取一次、劃無菌平板 2個。補料罐每 4小時取無菌樣一次. 劃無菌平板 2個。5.2 用 75%酒精棉擦凈取樣試管壁外沿的發(fā)酵液，置 36-37恒溫室培養(yǎng)。5.3 取無菌樣注意事項：5.3.1取無菌樣時要提前半小時開蒸汽消毒取樣管路 15分鐘，蒸汽壓力在 0.2MPa以上。5.3.2取無菌樣要求穩(wěn)、準、快，取少許培養(yǎng)液入無菌試管內。5.3.3 取消后樣時，放凈取樣管路冷凝水，溫度低于 33方可取樣，取其它無菌樣先讓發(fā)酵液流一會再取。5.3.4取無菌樣時，關閉窗戶，不讓周圍空氣流動。5.3.5取樣不能使棉塞沾濕。6 無菌樣品的檢查和異常情況的分析判斷6.1

8、 每班需要及時檢查無菌樣 34次，并做好記錄，交接班時應交接無菌反映情 SOP IPC 143 00第 4頁共 8頁況，有異常情況及時與車間工藝員、消毒有關人員聯(lián)系。6.2 如果發(fā)現(xiàn)無菌平板菌落生長有異?，F(xiàn)象，需及時進行鏡檢。6.3 連續(xù) 2個時間樣品有雜菌落生長，鏡檢同一菌型，或者實樣鏡檢確定發(fā)現(xiàn)雜菌（誤差樣除外），可判斷該罐染菌，出染菌通知單，必要時 4 小時加放，及時出染菌通知。6.4 種子罐無菌樣品進大罐 24小時方可處理，大罐無菌樣保留當班前 4個樣品，此前樣品可以處理。7涂片(無菌檢測)火 焰火 焰涂片步驟：涂片-干燥固定-染色-水洗-干燥固定-觀察用肥皂水洗凈載玻片，浸泡在 75

9、%酒精中備用，用接種針蘸少量發(fā)酵液涂在載玻片上，用蒸鎦水稀釋用酒精燈火焰干燥，用結晶紫染色一分鐘后用水沖凈晾干或酒精燈烤干固定，片上滴一滴香柏油，以油鏡觀察。7.1 涂片鏡檢后應保留一天后處理，浸泡在來蘇兒溶液中，載玻片清洗時將浸泡在來蘇兒溶液里的載玻片取出先用開水沖洗片刻，放入適量洗衣粉，并浸泡片刻，即可用清水沖洗直至漂清，再用干凈的軟布拭干備用。8菌體形態(tài)涂片鏡檢將接種針在酒精燈火焰上燒紅后拭冷，挑取肉眼可見的菌球（發(fā)酵液可不用挑菌球，直接取料液涂）一個或幾個于干凈載玻片上，滴一滴棉蘭染液，蓋上蓋玻片，加蓋時注意盡量使片上沒有小氣泡，用 40X16顯微鏡觀察。9 種子罐移種的鑒定9.1 種

10、子罐移種前 1小時認真鏡檢全部無菌樣，有無染菌， 對無菌情況作出正確判斷。9.2 要根據生化結果、PH、菌體形態(tài)、還原糖、外觀等檢查種子生長代謝是否正常。9.3 如斷定種子無菌且生長正常可通知消毒者移種， 移種通知在 2小時內有效，若因故推遲，需重新鏡檢樣品(降溫或加溫)。9.4 要嚴格控制種子罐移種標準，如果種子生長速度過快、過慢或大罐因故拖延進度應及時采取相應措施。9.5 種子罐移種標準：9.5.1 一級種子： SOP IPC 143 00第 5頁共 8頁9.5.2培養(yǎng)時間 55-75h，酶活力在 800-1000u/ml，PH呈下降趨勢；9.5.3鏡檢及平皿無凝點、菌球典型，輪廓粗壯；以

11、鏡檢通知單及平皿檢驗合格為準。9.6 二級種子：9.6.1 培養(yǎng)時間 40-50h ，酶活力在 8000-10000u/ml，PH4.5-4.8；9.6.2 還原糖值在 50%以上；9.6.3 鏡檢無疑點，菌球典型、粗壯；平皿檢驗合格。10 常用試劑的配制10.1 5%石碳酸：苯酚 5g加水(自來水)至 100ml。10.2 2%的來蘇爾：50%的來蘇兒 40ml加自來水至 1000ml。10.3 75%的酒精：95%酒精 79ml加自來水 21ml。10.4 10%KOH：KOH 10g加蒸餾水至 100ml。10.5 0.3%美蘭染色液：稱取美蘭 3g 溶于 95%酒精 100ml 中，即

12、成飽和原液放置 24小時，加蒸餾水制 1000mL容量瓶中搖勻備用。10.6 過氧乙酸混和液：過氧乙酸和過氧乙酸和過氧乙酸等量混和放置 24 小時以后再用。10.7 1%酚紅 1g溶于酒精中用水稀釋至 100ml。10.8 0.25%新潔爾滅：5%原液 100ml加水至 2000ml。10.9 洗滌液：重鉻酸鉀 15g加濃硫酸 200ml加熱半小時用玻璃絲過濾。、 SOP IPC 143 00第 6頁共 8頁B 液：草酸銨(ammonium oxalate) 08g蒸餾水 80ml混合 A、B 二液，靜置 48 小時后使用。2盧戈氏(Lugol)碘液碘化鉀 20g蒸餾水 300ml先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足石炭酸 10g乳酸(比重 121) 10ml甘油 20ml蒸餾水 10ml棉藍(cottonblue) 002g將石炭酸加在蒸餾水中加熱溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉藍，使其溶解即成。本崗包括記錄有：SZ FJ M1030 00SZ FJ M1031 00SZ FJ M1032 00SZ FJ M1033 01SZ FJ M1034 00SZ FJ M1035 00超凈臺菌落數(shù)測定 SOP IPC 143 00第 7頁共 8頁SZ FJ M1038 00SZ FJ M1039 00SZ FJ M1