細胞凍存與復(fù)蘇技術(shù)

1、細胞凍存與復(fù)蘇技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)自1907年開創(chuàng)以來，歷經(jīng)一個世紀現(xiàn)已成為自然科學領(lǐng)域不 可缺少的研究方法之一。在細胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛用于科學研究領(lǐng)域的令天，細胞株 的冷凍保存和解凍復(fù)蘇這一基礎(chǔ)技術(shù)日益得到重視。低溫保存是活體組織保存最常用的方法之一。冷凍保存一般是指在0 196 C 進行保存，就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的 冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。主要有 -20-40C冰箱保存、-60-80C深低溫冰箱和液氮（一 196C）超低溫保存等。應(yīng)用方向醫(yī)學方面近年來干細胞的研究越來越被人們關(guān)注，由于它是一種具有自我復(fù)制能力的 多潛能細胞，在

2、一定條件下，可分化為多種功能細胞。根據(jù)發(fā)育階段和取材來源，干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。骨 髓和臍血是成體干細胞的主要來源。骨髓干細胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細胞的十萬分之一，所以要在 臨床上廣泛應(yīng)用首先必須具備先進的凍存與復(fù)蘇技術(shù)。而干細胞研究的深入將解決包括癌癥等一系列為人們所知的“絕癥”。而 “冬眠”技術(shù)對醫(yī)學的發(fā)展有著里程碑式的意義。生物學方面細胞凍存技術(shù)是生物學保存物種的重要手段。在環(huán)境遭到史無前例的破壞動 物、植被隨時可能面臨滅絕危險的今天，更是尤為關(guān)鍵，雖然不是治本的方法， 但至少可以盡可能的留下那些曾經(jīng)存在的生命痕跡。發(fā)展歷史1776年.Spallanzani最

3、早發(fā)表了 “冷”處理對“細胞”生命活動影響的報 道。十九世紀中后葉，許多早期的工作者（Prevost，1840； de Quatrefages，1853； Mantegazza，1866； Scheuk， 1870）重復(fù)研究了低溫處理對精子活動的影響，得 出了和Spallanzani相似的結(jié)論。即“冷不能殺死精子”。1900年前后，科學家基本上肯定了生物成份能夠在零下溫度儲存的事實。二十世紀50年代Luyet等多位學者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對儲存細胞的損傷作 用，他們的基本結(jié)論是。電解質(zhì)濃度增大是造成儲存細胞損傷的主要原因。1972年.Mazur等首先根據(jù)中國倉鼠組織培養(yǎng)細胞的低溫保存實驗數(shù)據(jù)分析，

4、 提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。這個假說認為隨著溫度的下降，細胞內(nèi)外的水分結(jié)冰，所形成的冰晶會造成 細胞膜和細胞器的破壞并引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細胞損傷即 就是冰晶損傷（Intracellular ice damage）。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成， 冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時隨著溫度的下降.細胞外部的水分會先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中 電解質(zhì)濃度升高，細胞膜上的脂質(zhì)會因長時問暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損 壞，細胞發(fā)生滲漏，導(dǎo)致在復(fù)溫時大量水分滲入細胞內(nèi)造成細胞死亡。這種因保 存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶液損傷（Solution

5、 damage）。溶液 損傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻 速度越慢，此損傷越嚴重。凍存技術(shù)凍存技術(shù)液氮法目前，細胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的 緩慢冷凍法凍存細胞。細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞內(nèi)水分，減少細 胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解 度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明 顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的 機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。細胞凍

6、存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%20%的血清培養(yǎng)液， DMSO （分析純）或無色新鮮甘油（121C蒸氣高壓消毒），2mL安甑（或?qū)Ｓ眉毎麅?存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。主要操作步驟為：（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶 中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量 新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞 懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心 （1000r/min，10 分鐘）。（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，于4C預(yù)冷15

7、分鐘后， 逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為 3X1061X107/mL 之間。（3）將上述細胞分裝于安甑或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤校碴笛b11.5mL在火焰 噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細 胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。（4）將裝好細胞的安甑或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放 過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安甑 置入4C冰箱中23小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)34小時（此步可省略），再 吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，最后沉入液氮中。分布降溫法細胞系

8、凍存程序：1）單層細胞的消化。將經(jīng)2448小時培養(yǎng)己長成單層的傳代細胞培養(yǎng)物棄去生 長液，加適量ATV，12分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經(jīng)0.51分鐘倒 去ATV，室溫或37oC溫箱作用23分鐘，視細胞解離情況，拍打細胞培養(yǎng)瓶。使 單層細胞完全解離。SP2 / 0瘤細胞，待生長好后用吸管吹打，再經(jīng)1 000轉(zhuǎn)/分 離心io分鐘。 2離心洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加51 0m1預(yù)冷的MEM使細胞懸浮，再將其吸出置滅 菌離心管中，以1 000rpm離心810分鐘后棄去上清液。細胞懸液的制備：向離心管內(nèi)逐滴緩慢加入預(yù)冷的凍存保護液，使細胞濃度 為150400萬/ml，然后迅速分裝于安甑瓶中，每瓶加量

9、為lml。致冷凍結(jié)：將安甑瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內(nèi)，直立置不同條件下致 冷凍結(jié)果保存：a、4oC兩小時后移至一 2OoC作用2小時，再移入一 4OoC4小時后在一 7OoC下24 小時投入液氮。b， 20oC4小時后移致一 4OoC。C經(jīng)4小時移人一 7OoC冰箱24小時，投入液 氮。c，一 4OoC4小時后移入一 70oC24小時后投入液氮。d、一 20oC4小時后移入一 70oC經(jīng)24小時后投入液氮中。e、一 70oC24小時后投入液氮中。液氮中保存：將凍結(jié)后的安甑裝入預(yù)冷的小布袋中，投入液氮。為防止安甑 漂浮，可預(yù)先在小布袋中加入幾塊小卵石。玻璃化法玻璃化保存(Vitrificat

10、ion)是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍 細胞，使細胞內(nèi)外的游離水迅速形成玻璃樣物質(zhì)，而不形成冰晶。這種保存方法 既避免了由于慢速降溫時導(dǎo)致的鹽濃度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理 損傷，可獲得較高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他認為生命是生物活體系統(tǒng)的原子或 其他結(jié)構(gòu)元的一種特殊排列.并且輕微的排列位置擾動就會破壞平衡從而導(dǎo)致死 亡，而結(jié)冰時的驅(qū)動力會破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃 化比凍結(jié)固化方法引起的結(jié)構(gòu)變化要小，因而是一種較理想的低溫保存途徑。1981年，F(xiàn)ahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護劑溶液，可在較慢地冷 卻速率以及高壓條件下實現(xiàn)

11、完全的玻璃化，以后又發(fā)展了一些所謂“玻璃化溶 液”，使細胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統(tǒng)玻璃化低溫保存成為可能。1985年，Rail和Fahy目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功， 是這種技術(shù)走向?qū)嵱没氖状瓮黄?。?fù)蘇技術(shù)細胞復(fù)蘇的原則在實際操作中，凍存細胞要進行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細胞一般采用快速 融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形 成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。細胞復(fù)蘇的主要操作步驟佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安甑或冷凍管。迅速放入38C水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在 無菌下取出細胞。在1000r/min速度下離心510分鐘，棄

12、去上層液，加入適量培養(yǎng)液后 接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1X109/L，置37C溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接 將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)1224小時后，充去上清，換入新鮮 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項在細胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安甑或冷凍 管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-50C）。這樣復(fù)蘇的凍存細胞存活率 高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有 部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（己死亡）的細胞輕輕倒掉， 再補以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的

13、結(jié)果。技術(shù)總結(jié)要點冷凍速度冷凍速度也就是降溫的速度，它與冷凍效果直接相關(guān)。Morris認為在冷凍 過程中生物物理作用比生物化學作用更重要。冷凍速度、細胞收縮引起細胞膜和 細胞器的變化是造成損傷的主要因素目。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向細胞外流 動的情況也會不同。如果冷凍速度過慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮 小，同時細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；冷凍速度過快，細胞內(nèi)水分 沒有足夠時間外滲，隨著溫度的下降，細胞內(nèi)會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤?細胞內(nèi)形成的冰晶反而非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。不同的冷凍速度會使細胞內(nèi)外產(chǎn)生不同的生理變化，同樣也會對細胞造成損 傷。冷凍

14、速度過慢，細胞嚴重脫水，體積急劇收縮.超過一定程度時細胞失去活 性。冷凍速度過慢會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶 質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶液損傷。冷凍速度過快，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會在胞內(nèi) 形成較大冰晶，造成細胞膜和細胞器的損傷，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。1937年， Luyet實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，液體中的分子呈有序的排 列；另一種為非晶體化即玻璃化，液體中的分子呈無序排列，保持未凝固前的狀 態(tài)。故從細胞存活角度來說玻璃化冷凍是最為理想的凍存方法。細胞內(nèi)外呈玻璃 化凝固。無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不造成破壞；細胞也 不會在高濃度溶質(zhì)的溶液中因

15、暴露時間過長而受損。不同細胞的最適冷凍速度不同，主要取決于水分滲透過程是否與降溫速度相 匹配；同時還取決于細胞的表面積與體積之比，以及細胞膜的滲透率。一般來說。 小細胞（如紅細胞等）對水通透性強，適用于快凍，最佳冷凍速率較高，可達 103oC / min或更高；相反大的細胞或組織，如直徑100 m以上的胚胎，對水的通 透性弱，則適于慢凍。此外，最佳冷凍速度還受是否應(yīng)用防凍劑、防凍劑的含量 以及培養(yǎng)的細胞所處的狀態(tài)等多方面的因素影響。目前被普遍接受的是皮膚的低 溫保存中采用慢凍快復(fù)溫，一般認為降溫速率以15 oC / min為最佳。冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指長久保存細胞的超低溫度，在此溫度下，

16、細胞生化反應(yīng)極 其緩慢甚至停止。經(jīng)過長期保存的細胞和組織在復(fù)蘇后仍能保存正常的結(jié)構(gòu)和功 能。冷凍保存溫度可以隨著不同的細胞和生物體以及不同的冷凍保存方法而不 同。液氮溫度（-196。是目前最佳冷凍保存溫度。在-196 C時，細胞生命活動 幾乎停止，但復(fù)蘇后細胞結(jié)構(gòu)和功能完好。應(yīng)用-70-80 C條件冷凍保存細胞， 短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在 040匕范圍內(nèi)保存細胞效果不佳。復(fù)蘇復(fù)溫速度是指在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。冷凍保存體外培養(yǎng)物，除了必 須有最佳的冷凍速度、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也需要有最佳 的復(fù)溫速度，這樣才能保證最終得最佳冷

17、凍保存效果。與冷凍過程相比，復(fù)溫過 程的研究顯得薄弱得多。復(fù)溫速度不當同樣會造成細胞損傷，降低凍存細胞存活率。其損傷發(fā)生非常 快，持續(xù)時間也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通過對酵母細胞 的冷凍研究發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中胞內(nèi)形成的冰晶并未對細胞造成致命的損傷，反而 是在復(fù)溫過程中，復(fù)溫到-40C或者更高的溫度時，細胞內(nèi)會重新形成較大冰晶 而造成細胞的致命損傷。常規(guī)的做法是，在37C水浴中，于12 min內(nèi)完成復(fù) 溫，也就是通常采用的快速復(fù)蘇。因此，最佳復(fù)溫速率與最佳冷凍速率對保證獲 得最佳凍存效果同等重要。凍存保護劑凍存保護劑(Cryoprotectant)是指可以保護細胞免受冷

18、凍損傷的物質(zhì)(常為 溶液)。細胞懸液中加入冷凍保護劑可保護細胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍 保護劑同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性 增加從而減少冰晶的形成.同時冷凍保護劑可以通過在細胞內(nèi)外維持一定的摩爾 濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷。冷凍 保護劑根據(jù)其是否穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑 多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細胞膜滲透到細胞內(nèi)。該類保護劑主要包括二甲 基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。 其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一 定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高 濃度電解質(zhì)的損傷同時。細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。 在使用該類冷凍保護劑時，需要一定時間進行預(yù)冷，在細胞內(nèi)外達到平衡以起到 充分的保護作用。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。非