細(xì)胞培養(yǎng)污染

1、常見細(xì)胞污染細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見的問題，有時(shí)會(huì)造成非常嚴(yán)重的 后果。細(xì)胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類，一類是化學(xué)污染物，如培養(yǎng)基、血清和水 中的雜質(zhì)，包括內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑，另一類是生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、 酵母、病毒和支原體，以及其他細(xì)胞系的交叉污染。雖然污染無法完全消除，但 可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術(shù)來降低污染的發(fā)生頻率和嚴(yán)重 性。本次將概述主要的生物污染類型。污染種類1.細(xì)菌細(xì)菌是一大類普遍存在的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌的直徑通常只有幾微米，其形狀多 樣，如球狀、桿狀和螺旋狀等。由于分布廣泛、生長迅速和體積大小等特點(diǎn)，細(xì) 菌以及酵母和霉菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見

2、的生物污染物。細(xì)菌污染在培養(yǎng)物感染后 幾天內(nèi)就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會(huì)變得渾濁，有時(shí)表面會(huì)有 一層薄膜。經(jīng)常還會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況。在低倍顯微鏡下，細(xì) 菌以細(xì)小顆粒的形式出現(xiàn)在細(xì)胞之間，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個(gè)細(xì)菌 的形狀。下面的模擬圖像顯示了貼壁培養(yǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染。AB匚被大腸桿菌污染的貼壁293細(xì)胞的模擬相差圖像。在低倍顯微鏡下，貼壁細(xì)胞之間有一些發(fā)亮的微小顆粒，但單個(gè)細(xì)菌 不易區(qū)分（圖A）。進(jìn)一步放大黑色正方形框出的區(qū)域后，可以顯現(xiàn)出單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，這些細(xì)胞通常呈桿狀，長約 2呻，直徑約0.5呻。圖A中黑色正方形的邊長為100呻。2.酵

3、母酵母是真菌界中的單細(xì)胞真核微生物，大小從幾微米（常見）到40 pm （罕見） 不等。與細(xì)菌污染一樣，被酵母污染的培養(yǎng)物會(huì)變得混濁，尤其是在污染的后期。 被酵母污染的培養(yǎng)物，其pH值幾乎沒有變化，通常直到污染嚴(yán)重時(shí)，pH值才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵球形或球形顆粒，可能還會(huì)出芽產(chǎn)生更小的顆粒。下面的模擬圖像顯示了貼壁293細(xì)胞鋪板粒。下面的模擬圖像顯示了貼壁293細(xì)胞鋪板24小時(shí)后被酵母感染的情況。被酵母污染的貼壁293細(xì)胞培養(yǎng)物的模擬相差圖像。酵母細(xì)胞呈為卵球形顆粒，增殖時(shí)會(huì)出芽產(chǎn)生更小的顆粒。3.霉菌霉菌是真菌界的真核微生物，以多細(xì)胞絲狀體生長，稱為菌絲。這些多細(xì)胞絲 狀體構(gòu)成的交聯(lián)

4、網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核，被稱為集落或菌絲體。與酵母 污染相似，培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物感染程度 加劇而迅速增加，并變得渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)長的絲狀體，有 時(shí)呈密集的孢子團(tuán)。許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生 長的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長條件時(shí)才會(huì)被激活。4.病毒病毒是一種微小的感染性病原體，利用宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行繁殖。它們的體積 極小，難以在培養(yǎng)中被檢測到，也難以從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑中去除。由于大多數(shù)病毒對宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此，它們通常不會(huì)對宿主以外物 種的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響。但被病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)對實(shí)驗(yàn)室人員造 成

5、嚴(yán)重的健康威脅，尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人類或靈長類的細(xì)胞時(shí)。要檢測 細(xì)胞培養(yǎng)物是否被病毒感染，可以使用電子顯微鏡觀察、用抗體組合進(jìn)行免疫 染色、ELISA檢測或是使用合適的病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5.支原體支原體是無細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是最小的自我復(fù)制生物。由于支原體非 常?。ㄍǔＰ∮? 命，因此很難被檢測到，除非它們達(dá)到了極高的密度，導(dǎo) 致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)；在此之前，通常沒有明顯的感染跡象。一些生長緩慢的支 原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活，而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但它們可以改變培養(yǎng)體系 中宿主細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖率降低、飽和密度下降以及懸浮培 養(yǎng)物凝集；但是，檢測

6、支原體污染的唯一可靠方法是通過使用熒光染色（例如 Hoechst33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定法定期 檢測培養(yǎng)物。無支原體細(xì)胞和支原體感染細(xì)胞的顯微照片。使用Invitrogen MycoFluor支原體檢測試劑盒，按照試劑盒操作流程對培養(yǎng)物進(jìn)行檢測。（A）在固定細(xì)胞中，MycoFluor試劑可進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞核著色明顯，但核外無熒光物質(zhì)，表明培養(yǎng)物未被支原體污染。（B）在被支原體感染的固定細(xì)胞中，MycoFluor試劑可對細(xì)胞核和支原體進(jìn)行染色，但細(xì)胞核相對 強(qiáng)烈的熒光會(huì)使細(xì)胞核上或細(xì)胞核周圍的支原體顯得模糊。然而，遠(yuǎn)離高亮度細(xì)胞核的支原體可被清晰地觀

7、察到。（C）在活細(xì)胞中，MycoFluor試劑無法進(jìn)入細(xì)胞核，但容易使細(xì)胞外結(jié)合的支原體染色。試劑盒中所用對照品的發(fā)射 光譜，與按照操作流程進(jìn)行染色的支原體的發(fā)射光譜非常一致，且強(qiáng)度均勻，便于研究人員區(qū)分染色的支原體和其他 背景熒光，包括病毒、細(xì)菌，以及細(xì)胞自發(fā)熒光。上述圖像使用365 nm激發(fā)光、100/1.3 Plan Neofluar物鏡以及450 30 nm帶通濾光片獲得。交叉污染（若發(fā)生非常嚴(yán)重！ ！）雖然不如微生物污染普遍，但許多細(xì)胞系與HeLa以及其他快速生長細(xì)胞系之間 的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個(gè)明確的問題，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。從值得信賴的細(xì) 胞庫中獲取細(xì)胞系，定期檢查細(xì)胞系的特性，并使用良好的無菌技術(shù)進(jìn)行操 作，這些做法都將幫助您避免交叉污染。DNA指紋圖譜分析、核型分析和細(xì)胞 亞型分析可以確定細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染。抗生素使用請勿在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素，因?yàn)榭股氐倪B續(xù)使用會(huì)促進(jìn)耐藥菌株的 生長，并導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，就會(huì)發(fā)展成 大規(guī)模污染?？股氐某掷m(xù)使用還可能掩蓋支