第二章細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)細胞的特點課件

1、細胞工程的研究范疇細胞與組織培養(yǎng) 細胞融合 細胞核移植 染色體工程 胚胎工程 干細胞與組織工程 轉(zhuǎn)基因生物與生物反應(yīng)器.細胞工程的研究范疇細胞與組織培養(yǎng).第二章 細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特點.第二章 細胞培養(yǎng).第一節(jié) 組織培養(yǎng)(tissue culture) 組織培養(yǎng)（tissue culture）習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)的總稱。其本意是指從活的機體中取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)稱為組織培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)這一名詞實際上是一個通用名詞，其實際內(nèi)容根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個不同概

2、念： 一、組織培養(yǎng)的基本概念.第一節(jié) 組織培養(yǎng)(tissue culture) 組 組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程稱為組織培養(yǎng)。從組織塊中生長出來的仍然是細胞，細胞在生長的同時也發(fā)生移動，至使組織中的培養(yǎng)難以長時間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細胞培養(yǎng)。 細胞培養(yǎng)：將組織塊用機械方法或酶解法分離成單個細胞，做成細胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細胞培養(yǎng)。 器官培養(yǎng)：所謂器官培養(yǎng)，是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培

3、養(yǎng)技術(shù)稱為器官培養(yǎng)。 . 組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的體外培養(yǎng)的種類.體外培養(yǎng)的種類. 二、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點. 二、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點.1.研究的對象是活細胞 在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。.1.研究的對象是活細胞.2. 研究條件可以人為控制 可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。.2. 研究條件可以人為控制.3. 研究的樣本可以達到比較均一性 通過細胞培養(yǎng)一

4、定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。.3. 研究的樣本可以達到比較均一性.4. 研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄 采用各種研究技術(shù)、記錄方法：研究: 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯 微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫 組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記 記錄: 攝影照片、縮時電影、電視.4. 研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄.5.研究的范圍比較廣泛 學(xué)科多：病毒學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、臨床 醫(yī)學(xué)等 對象廣： 各種動物：低等動物、高等動物、人類 一種動物：不同年齡、不同組織、正?；?異常（腫瘤）.5.研究的范圍比較廣泛.6.研究

5、的費用相對較經(jīng)濟 可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象。.6.研究的費用相對較經(jīng)濟.三、細胞培養(yǎng)的缺點.三、細胞培養(yǎng)的缺點.1、體外培養(yǎng)的細胞，尤其是反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)者，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。2、 細胞培養(yǎng)對人員、設(shè)備等條件都要求較高。這些都影響細胞培養(yǎng)技術(shù)的更廣泛應(yīng)用。3、動物細胞的培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求較高。4、動物細胞培養(yǎng)的另一個突出特點，是對環(huán)境條件要求嚴(yán)格。 .1、體外培養(yǎng)的細胞，尤其是反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)者，有可能發(fā)生染 正確認(rèn)識：現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但, 人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同，當(dāng)細胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏

6、動態(tài)平衡的環(huán)境中,久了，必然發(fā)生變化。 因此，對于體外培養(yǎng)的細胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細胞完全等同。. 正確認(rèn)識：現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但, 人工第二節(jié) 細胞培養(yǎng)的細胞生物學(xué).第二節(jié) .一、體內(nèi)外細胞的差異及分化.一、體內(nèi)外細胞的差異及分化.（一）體內(nèi)外細胞的差異 培養(yǎng)細胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖” 現(xiàn)象；表現(xiàn)為細胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細胞群。.（一）體內(nèi)外細胞的差異.1.與體內(nèi)主要不同 相對孤立、相對單一，缺乏體

7、內(nèi)的系統(tǒng)作用，失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。 .1.與體內(nèi)主要不同.2.主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯 細胞趨向單一化； 3.提示要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細胞是一種特定條件下生長的細胞群體。.2.主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 分化減弱或（二）培養(yǎng)細胞的分化1不適應(yīng)(Deadaption)： 表現(xiàn)為，細胞在原體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯，如肝細胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的喪失.2脫分化或去分化(Dedifferentiation) 細胞也可能出現(xiàn)脫分化或去分化，即細胞失掉發(fā)生分化的能力。.（二）培養(yǎng)細胞的分化1不

8、適應(yīng)(Deadaption)：2.二、培養(yǎng)細胞形態(tài)分類.二、培養(yǎng)細胞形態(tài)分類.體外細胞培養(yǎng)物的生長類型 按生長方式分為兩種類型 貼附型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。 懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下 即可生長的細胞。 絕大多數(shù)有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。 .體外細胞培養(yǎng)物的生長類型 按生長方式分為兩種類型.貼附(粘附)型細胞 粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結(jié)果：基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結(jié)合形成組織，有機體的絕大多數(shù)細胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)時：這些細

9、胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞。.貼附(粘附)型細胞 粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長 細胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細胞只有一個附著平面 外形一般與體內(nèi)時明顯不同 按照培養(yǎng)細胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為4大類型 .分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要4類： 上皮細胞型 成纖維細胞型 游走細胞性 多形型細胞 .分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要4類：.上皮細胞型 名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于。來源

10、：來源于外胚層，內(nèi)胚層細胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 .上皮細胞型 名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于。. 生長特點 易相連成片，相靠緊密相連，成薄層鋪石狀。 生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動 體外培養(yǎng)細胞類型（1）上皮細胞型. 生長特點體外培養(yǎng)細胞類型（1）上皮細胞型.成纖維細胞型 名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細胞、心肌、平滑肌、 成骨細胞，血管內(nèi)皮。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起

11、 中有卵圓形核.成纖維細胞型 名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的.生長特點 排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞細胞接觸易斷開而單獨行動。 游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。體外培養(yǎng)細胞類型（2）成纖維細胞型.生長特點體外培養(yǎng)細胞類型（2）成纖維細胞型.游走細胞型 細胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動， 貼附于支持物上散在生長，一般不連接成片。該類細胞形狀很不穩(wěn)定，有時與上皮樣細胞 或成纖維細胞難以區(qū)別。單核細胞、巨噬細胞及某些腫瘤細胞在體外培養(yǎng)時常呈現(xiàn)此種形態(tài)。.游走細胞型.多形型細胞 生長時像神經(jīng)細胞那樣呈多角形，并伸出較長的神經(jīng)纖維，很難確定它們的形狀

12、，因而我們將此類細胞稱為多形型細胞。體外培養(yǎng)時常見的多形型細胞是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 .多形型細胞.貼附生長型的培養(yǎng)特點1. 與體內(nèi)同名的細胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細胞，可不同來源。 自同一動物不同組織的成纖維樣細胞相 似但發(fā)展趨向不同2.培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定 條件改變，細胞形態(tài)可能有變化 .貼附生長型的培養(yǎng)特點1. 與體內(nèi)同名的細胞不完全相同.培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)pH 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 細胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓

13、形 成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣 .培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 懸浮生長型概念 培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源 自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞。癌、腫細胞也可能特點 在懸浮中生長良好，細胞圓形，單個或小細胞團.懸浮生長型概念.優(yōu)點 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點 觀察不方便 很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞) .優(yōu)點 .三、培養(yǎng)細胞的生長特點.三、培養(yǎng)細胞的生長特點. （一）貼附（二）接觸抑制（三）密度抑制. （一）貼附（二）接觸抑制（三）密度抑制.四、培養(yǎng)細胞的生長和

14、增殖過程.四、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程.（一）單個細胞的生長過程.（一）單個細胞的生長過程.（二）培養(yǎng)細胞生命期 (Life Span of Culture Cells)所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。.（二）培養(yǎng)細胞生命期所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)正常培養(yǎng)的細胞周期.正常培養(yǎng)的細胞周期.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期 也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點：細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。.原代培養(yǎng)(Primar

15、y Culture)期 也稱初代培養(yǎng)特點：在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺 盛，并能維持二倍體核型。傳代期： 傳代：體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。.特點：在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺 盛衰退期： 特點：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。.衰退期：.（三）體外培養(yǎng)細胞一代生存期潛伏期指數(shù)增生期停止期所謂細胞的“一代”是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)

16、的一段時間。.（三）體外培養(yǎng)細胞一代生存期潛伏期所謂細胞的“一代”是指從細潛伏期：包括懸浮期及潛伏期。當(dāng)細胞接種入新的培養(yǎng)器皿，不論是何種細胞類型、其原來的形態(tài)如何，此時細胞的胞質(zhì)回縮，胞體均呈圓球形。先懸浮于培養(yǎng)液中，短時間后，那些尚可能存活的細胞，即開始附著于底物，并逐漸伸展，恢復(fù)其原來的形態(tài)。再經(jīng)過一潛伏期，此時細胞已存活，具有代謝及運動但尚無增殖發(fā)生。以后出現(xiàn)細胞分裂并逐漸增多而進入指數(shù)生長期。 .潛伏期：包括懸浮期及潛伏期。當(dāng)細胞接種入新的培養(yǎng)器皿，不論是指數(shù)增生期：又稱對數(shù)期。此期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。細胞生長增殖狀況可以細胞倍增情況（細胞群體倍增時

17、間）及細胞分裂指數(shù)等來判斷。在此階段，若細胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長繁殖，細胞數(shù)量日漸增加。細胞將接觸而連成一片，漸次長滿培養(yǎng)器皿底面，提供細胞生長的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制而細胞運動停止、密度抑制而細胞終止分裂。.指數(shù)增生期：又稱對數(shù)期。此期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳 停止期： 又稱平臺期，此期可供細胞生長的底物面積已被生長的細胞所占滿，細胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。此時細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續(xù)存活一定的進間。若及時分離培養(yǎng)、進行傳代，將細胞分開接種到新的培養(yǎng)器皿并補充以新鮮培養(yǎng)液，細胞將于新的培養(yǎng)器皿中成為下代的細胞而再次繁殖。否則，若傳代不及時，細

18、胞將因中毒而發(fā)生改變，甚至脫落、死亡。 每次傳代接種后，細胞的這些生長繁殖過程，若進行檢測計數(shù)，可以繪制成曲線，是為生長曲線。各細胞的生長曲線各具特點，是該細胞生物學(xué)特性的指標(biāo)之一。. 停止期： 又稱平臺期，此期可供細胞生長的底物面積已被生長的五、體外培養(yǎng)細胞的遺傳學(xué)特征（一）染色質(zhì)和染色體： 人體體細胞具有二倍體核型，染色體數(shù)目為46（2N）。原代培養(yǎng)細胞多呈二倍體，經(jīng)傳代成細胞系后，細胞可保持二倍體狀態(tài)。但經(jīng)長期傳代可能發(fā)生偏離二倍體現(xiàn)象，即染色體數(shù)多于或少于46。當(dāng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或腫瘤細胞，大多失去二倍體核型，成為多倍體或異倍體。在各類培養(yǎng)細胞中，有時會見到異常的染色體，如雙著絲點、環(huán)形染

19、色體，長臂或短臂.五、體外培養(yǎng)細胞的遺傳學(xué)特征（一）染色質(zhì)和染色體：.（二）細胞性別 在23對染色體中有一對性染色體，女性的兩個X染色體中有一個在間期呈明顯的異固縮狀態(tài)，呈半月形或三角形小體，稱Barr小體，緊貼在核膜內(nèi)面。男性Y染色體在間期形成顆粒狀Y小體，位于胞核近中央位。培養(yǎng)細胞的細胞核超微結(jié)構(gòu)與體內(nèi)細胞無大差別，仍保持性別特征，尤其原代培養(yǎng)細胞易于顯示，用特殊染色法均可觀察到Barr小體和Y小體。.（二）細胞性別.六、體外培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境（一）無污染環(huán)境 無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒