生物制藥工藝技術基礎課件

1、第二章 生物制藥工藝技術基礎Basis of biopharmaceutical technology 1醫(yī)學ppt第二章 生物制藥工藝技術基礎Basis of bioph一、生物材料的選擇：1生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)2生物材料的采集與質(zhì)控 （1）品種鑒定；（2）防止污染與感染； （3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存第一節(jié)生物藥物提取、分離、純化技術基礎2醫(yī)學ppt一、生物材料的選擇：1生物活性物質(zhì)存在部位：胞二、生物活性物質(zhì)物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化（一）幾種常用提取方法 1酸、堿、鹽水溶液提取方法 2表面活性劑提取方法與反膠束提取方法 3有機溶劑提取 4.

2、 雙水相萃取法 5超臨界萃取法3醫(yī)學ppt二、生物活性物質(zhì)物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化（一）幾種常用提（二）提取方法與優(yōu)化1.溶劑選擇2.選擇添加劑 保護劑； 酶抑制劑3.提取條件 溫度； pH； 鹽； 表面活性劑4醫(yī)學ppt（二）提取方法與優(yōu)化1.溶劑選擇2.選擇添加劑 4醫(yī)學三濃縮與干燥 1.濃縮方法： 鹽析； 有機溶劑沉淀； 高分子脫水 超濾； 真空濃縮或薄膜濃縮； （書P45頁）5醫(yī)學ppt三濃縮與干燥 1.濃縮方法：（書P45頁）5醫(yī)學ppt6醫(yī)學ppt6醫(yī)學ppt2.干燥：低溫真空干燥；噴霧干燥；冷凍干燥（書P47頁）7醫(yī)學ppt2.干燥：低溫真空干燥；噴霧干燥；冷凍干燥（書P478醫(yī)

3、學ppt8醫(yī)學ppt9醫(yī)學ppt9醫(yī)學ppt四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點: (1) 生物材料組成復雜 (2) 目的物含量低 (3) 易變性、失活 (4) 分離方法有很大經(jīng)驗成分 (5) 步驟多，逐級分離 (6) 產(chǎn)品驗證與化學上純度概念不完全相同(書P49頁)10醫(yī)學ppt四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點:(書P49頁)12. 分離純化原理 P49頁 (1)根據(jù)分子形狀與分子大小 (2)根據(jù)電荷差異 (3)根據(jù)分子極性與溶解度大小 (4) 根據(jù)吸附特性 (5) 根據(jù)生物配基特性11醫(yī)學ppt2. 分離純化原理 3. 選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對低分辨率 鹽析，

4、分級沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率 多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦12醫(yī)學ppt3. 選擇原則12醫(yī)學ppt 第二節(jié) 微生物制藥工藝技術基礎一、菌種的選育與保藏1自然選育 依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離篩選，除去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達到強化、復壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的。 方法：（1）平板劃線法 （2）稀釋平板法13醫(yī)學ppt 第二節(jié) 微生物制藥工藝技術基礎一、菌種的選育2誘變育種（1）出發(fā)菌株的選擇 :穩(wěn)定性; :具備某種優(yōu)良性狀的菌株 :對誘變劑敏感; :生理狀態(tài)及生長時間（2）誘變處理: 化學誘變；物理誘變;生物誘變（3）篩選： 隨機篩選；半理性化篩選14醫(yī)學

5、ppt2誘變育種14醫(yī)學ppt突變株篩選一般進程如圖所示 第三第四輪同第二輪第三第四輪同第二輪15醫(yī)學ppt突變株篩選一般進程如圖所示 第三第四輪同第二輪15醫(yī)學pp3、現(xiàn)代菌種選育技術 ：雜交育種 ：原生質(zhì)體融合 ：基因工程技術 (P55頁)16醫(yī)學ppt3、現(xiàn)代菌種選育技術16醫(yī)學ppt3菌種保存（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法 防止基因突變：如低溫保藏 采用雙重缺陷型 制作平行的菌種斜面，少傳代 分離單菌落，自然篩選 選擇培養(yǎng)條件17醫(yī)學ppt3菌種保存（1）保存目的：防止退化17醫(yī)學ppt（4）菌種保藏方法： 斜面低溫保存 液體石蠟封藏法 甘油冷凍法

6、 冷凍干燥法 液氮保藏法18醫(yī)學ppt（4）菌種保藏方法：18醫(yī)學ppt二、發(fā)酵工程技術基礎發(fā)酵工程：單細胞純培養(yǎng)工業(yè)化過程，以產(chǎn)生大量目的物。1液體培養(yǎng)深層發(fā)酵2固體培養(yǎng)淺盤培養(yǎng)發(fā)酵設備：空壓機、種子罐、發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器、空氣過濾器、離心機及多種參數(shù)控制與檢測設備，以L-Lys生產(chǎn)設備為例，見圖1所示。19醫(yī)學ppt二、發(fā)酵工程技術基礎發(fā)酵工程：單細胞純培養(yǎng)工業(yè)化過程，以產(chǎn)圖1 L-Lys生產(chǎn)過程工藝設備圖20醫(yī)學ppt圖1 L-Lys生產(chǎn)過程工藝設備圖20醫(yī)學ppt 第三節(jié) 生物技術藥物制造技術基礎一、重組DNA技術原理1基因工程操作過程：（1）獲得目的基因；（2）構建DNA重組體；（3

7、）將重組體導入宿主細胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴增與蛋白表達。21醫(yī)學ppt 第三節(jié) 生物技術藥物制造技術基礎一、重組2基因工程藥物制造過程22醫(yī)學ppt2基因工程藥物制造過程22醫(yī)學ppt二、基因工程主要操作技術1目的基因的獲得（1）cDNA文庫 純化目的mRNA，逆轉錄成cDNA mRNA的分離 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA與載體連接 轉染或轉化 篩選目的克隆23醫(yī)學ppt二、基因工程主要操作技術1目的基因的獲得23醫(yī)學ppt目的基因的獲得：cDNA文庫24醫(yī)學ppt目的基因的獲得：cDNA文庫24醫(yī)學ppt（2）PCR法或逆轉錄PCR（RT-PC

8、R） 典型PCR反應包括 模板變性 94以上（12） 退火 5055（12） 延伸 72（12） 在高溫聚合酶作用下， 以DNA單鏈為模板， 由引物起始從53 延伸。25醫(yī)學ppt（2）PCR法或逆轉錄PCR（RT-PCR）25醫(yī)學ppt26醫(yī)學ppt26醫(yī)學ppt（3）化學合成法 在已知DNA序列或多肽的一般結構時，如鏈長在 60bp100bp可用化學合成法直接合成DNA。27醫(yī)學ppt（3）化學合成法27醫(yī)學ppt2DNA重組體的構建 根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli質(zhì)粒非表達型 pBR322，表達型pUC，實用型pBV220，PET系統(tǒng)，噬菌體DNA作為載體

9、，非表達型gt10，表達型gt11。（2）芽孢桿菌 pUB110 pE194和pC194（3）鏈霉菌 pIJ101 pSG5 cDNA與載體連接方法 同聚尾連接法 人工接頭連接法28醫(yī)學ppt2DNA重組體的構建28醫(yī)學ppt3重組體的表達系統(tǒng)（1）原核表達系統(tǒng) E.coli；芽孢桿菌Bacillus；鏈霉菌Streptomyces 優(yōu)點：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短 缺點：多為胞內(nèi)表達、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性29醫(yī)學ppt3重組體的表達系統(tǒng)29醫(yī)學ppt（2）真核表達系統(tǒng) 酵母表達 畢赤酵母（pichia psatoris）受甲醇誘導 優(yōu)點：易培養(yǎng)無毒

10、性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達。 動物細胞 哺乳動物細胞CHO（倉鼠細胞） 昆蟲細胞家蠶細胞30醫(yī)學ppt（2）真核表達系統(tǒng)30醫(yī)學ppt4表達產(chǎn)物的純化包含體 inclusion bodies: 大部分是表達產(chǎn)物，（還有細胞蛋白和膜蛋白）一級結構正確、無活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復性。31醫(yī)學ppt4表達產(chǎn)物的純化包含體 inclusion bodies: 為防止或減少包含體的形成常用方法： （1）降低培養(yǎng)溫度 從37降到30可顯著降低包含體形成率。 （2）以硫氧還原蛋白為載體進行融合表達。 硫氧還

11、原蛋白是E.coil的一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目的蛋白不發(fā)生分子錯誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，表達產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過振擾提取使產(chǎn)物進入介質(zhì)中，再酶解就得到目的蛋白。32醫(yī)學ppt 為防止或減少包含體的形成常用方法：32醫(yī)學p三、酶工程制藥技術基礎1、酶工程(enzyme engineering) 研究內(nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應用。（2）酶與細胞的固定化技術與酶反應器。（3）生物酶工程：以基因工程技術和蛋白質(zhì)工程技術研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶 合成酶及酶的人工設計。（書P102）33醫(yī)學ppt三、酶工程制藥技術基礎1、酶工程(enzyme engine2、固

12、定化酶(immobilized enzyme)（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強度，便于連續(xù)、自動、規(guī)?；a(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化34醫(yī)學ppt2、固定化酶(immobilized enzyme)34醫(yī)學共價鍵結合酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術和固定化酶35醫(yī)學ppt共價鍵結合酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術3、制備方法：（1）吸附法：分為物理吸附法和離子交換吸附法（2）包埋法：將酶或細胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺（3）共價鍵結合法：酶分子與載體分子，通過化學偶聯(lián)使酶與載體共價結合。（

13、4）交聯(lián)法：用雙功能試劑 將酶與載體交聯(lián)固定化 圖: 酶固定化方法示意1. 離子結合 2.共價結合 3.交聯(lián)4. 聚合物包埋 5. 疏水作用6. 脂質(zhì)體包埋 7. 微膠囊36醫(yī)學ppt3、制備方法： 圖: 酶固定化方法示意36醫(yī)學pp第四節(jié) 生物制藥工藝中試放大設計一、中試放大目的與規(guī)模1目的：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應臨床前與臨床研究；（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，保證能在以后生產(chǎn)中應用。37醫(yī)學ppt第四節(jié) 生物制藥工藝中試放大設計一、中試放大目的與規(guī)模12規(guī)模： 中試是由小試轉入工業(yè)化生產(chǎn)的過渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化的關鍵。38

14、醫(yī)學ppt2規(guī)模：38醫(yī)學ppt3、中試放大時應具備的條件 （1）有穩(wěn)定的工藝：收率，質(zhì)量可靠 （2）操作條件基本確立 （3）已建立中間品和成品分析方法 （4）生物材料已鑒定 （5）物料平衡、三廢處理已基本解決 （6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定 （7）安全生產(chǎn)已有方案39醫(yī)學ppt3、中試放大時應具備的條件39醫(yī)學ppt4中試放大要解決的問題（1）原輔材料規(guī)格 （2）設備選型與材質(zhì)選用 （3）反應條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標準與檢定方法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程的制定40醫(yī)學ppt4中試放大要解決的問題40醫(yī)學ppt二中試放大方法與總結內(nèi)容1、放大方法 （1）經(jīng)驗放大 （2）相

15、似放大 （3）數(shù)學模型放大2、總結內(nèi)容：（1）確定工藝路線，優(yōu)化工藝條件，制定制造規(guī)程。（2）制定崗位操作、投產(chǎn)（3）進行材料衡算（4）安全生產(chǎn)與處理（5）原輔料及產(chǎn)品質(zhì)控方法與標準測定。（6）產(chǎn)品規(guī)格標準制定（7）消耗定額，成本核算，工時，生產(chǎn)周期計算。 41醫(yī)學ppt二中試放大方法與總結內(nèi)容1、放大方法41醫(yī)學ppt 第五節(jié) 生物制藥工藝技術若干進展一、21世紀的熱門生物技術 1組合生物合成 組合生物合成(combinatorial biosynthesis)或組合生物學(combinatorial biology)是指應用基因重組技術重新組合微生物藥物的基因簇,產(chǎn)生一些新的非天然的基因簇

16、,從而合成許多新的非天然的化合物,為生物藥物的篩選提供豐富的化合物資源42醫(yī)學ppt 第五節(jié) 生物制藥工藝技術若干進展一、21世紀的 微生物藥物通常是由非常簡單的化學物質(zhì), 如小分子羧酸或某些氨基酸作為合成起始單位和延伸單位合成的, 參與合成的酶為一系列基因編碼的多酶體系 (構成一個合成途徑) 。研究表明, 參與這類小分子生物合成的基因通常是連鎖或鄰接而構成一個基因簇(cluster) , 這為基因的克隆和操作提供了方便, 同時由于參與次級代謝生物合成酶系對底物的特異性, 專一性要求不是很嚴格的, 對結構相類似的底物均可識別, 這一特點為不同基因組合產(chǎn)生新的化合物創(chuàng)造了條件。43醫(yī)學ppt 微

17、生物藥物通常是由非常簡單的化學物質(zhì), 如小分子羧酸組合生物合成技術在藥物研發(fā)中的應用酮基合成酶(KS)、酰基轉移酶（AT）、脫氫酶（DH）、烯醇還原酶（ER）、酮基還原酶（KR）和?；d體蛋白（ACP）等功能域44醫(yī)學ppt組合生物合成技術在藥物研發(fā)中的應用酮基合成酶(KS)、?；D45醫(yī)學ppt45醫(yī)學ppt組合生物合成技術示意圖酶 1酶 2酶 3化合物 A B C D酶1 基因酶2 基因酶3 基因基因克隆AD質(zhì)粒轉移至宿主菌酶或蛋白質(zhì)46醫(yī)學ppt組合生物合成技術示意圖酶 1酶 2酶 3化合物 2藥物基因組學 是一門研究個人的基因遺傳如何影響身體對藥物的反應的一門科學。由對基因的研究發(fā)現(xiàn)帶

18、有某種特定基因的人，會對某種特定的藥物成份，產(chǎn)生某種特定的反應。將這個基因、藥物成份與服用后反應的一連串關聯(lián)，運用在用藥之上，就可以知道帶有某特定基因之人，不適合服用含有某特定成份的藥物，進而降低藥物副作用產(chǎn)生的風險；反之，也可以知道帶有某特定基因之人，特別適合服用含有某特定成份的藥物，進而提升治愈疾病的機率 3藥物蛋白質(zhì)組學 47醫(yī)學ppt 2藥物基因組學47醫(yī)學ppt 4蛋白質(zhì)工程 5基因治療與基因疫苗 6糖基化工程 7先導物高通量篩選與藥物合理設計（rational drug design） 8核酶、抗體酶、干擾RNA 9藥物生物信息學 10功能抗體與人工智能技術和虛擬人技術48醫(yī)學ppt 4蛋白質(zhì)工程 48醫(yī)學ppt二、蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)的分子設計蛋白質(zhì)工程： 在基因水平上設計表達新的功能蛋白 1產(chǎn)品的特點 （1）改善穩(wěn)定性 （2）提高生物活性 （3）延長體內(nèi)半衰期 （4）降低免疫原性49醫(yī)學ppt二、蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)的分子設計蛋白質(zhì)工程：49醫(yī)學ppt2蛋白質(zhì)工程研究基本程序50醫(yī)學ppt2蛋白質(zhì)工程研究基本程序50醫(yī)學ppt3基因改造技術（1）基因定點突變技術 （2）DNA改造技