蛋白質(zhì)快速檢測儀測定乳及乳制品中蛋白質(zhì)

1、蛋白質(zhì)快速檢測儀測定乳及乳制品中蛋白質(zhì)引言 蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象中最基本的物質(zhì)基礎(chǔ) , 具有調(diào)節(jié)生理功 能 , 充當藥物分子、維生素、礦物質(zhì)與微量元素的載體等功能。 食用乳及乳制品是人體攝入蛋白質(zhì)的重要途徑之一。 為了保證乳 及乳制品的質(zhì)量 , 我國在生乳安全標準、 GB/T5410-2008 乳粉和 NY 5045-2001 無公害食品 生鮮牛乳等標準中都明 確規(guī)定了乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量要求。 但一些不法分子為了獲 取經(jīng)濟利益 , 向乳制品中添加含氮量高的無機物質(zhì)（如三聚氰 胺、尿素、硝酸銨等）以提高蛋白質(zhì)的含量 , 嚴重影響乳制品的 質(zhì)量和人們的身體健康。 有關(guān)乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量不達標所

2、 引起的食品中毒事件時有發(fā)生 , 乳制品安全引起了社會極大關(guān) 注。我國和國際上均出臺了一系列標準的乳及乳制品中蛋白質(zhì)含 量的測定方法，如凱氏定氮法1,2 、杜馬斯燃燒法35 等。凱氏定氮法是我國用于蛋白質(zhì)測定的常規(guī)檢測方法 , 它是通 過樣品消解將樣品中所有氮元素轉(zhuǎn)化為氨，通過H2S0載HCI標 準溶液進行滴定 , 實現(xiàn)樣品中蛋白質(zhì)的測定 , 完成一個樣品的 整個分析過程至少需要 2 h 。從其原理可知 , 樣品消解后所有氮 元素均轉(zhuǎn)化為氨 , 故該法無法區(qū)分蛋白質(zhì)氮與非蛋白質(zhì)氮。 2001 年, 國際標準化組織和國際乳品聯(lián)合會發(fā)布了乳制品中非蛋白 氮的測定標準方法 6 , 該法提出了蛋白氮和

3、非蛋白氮分離方法 , 彌補了凱氏定氮法不能區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮的缺陷 , 該 方法我國于 2008 年等同引用 7。杜馬斯燃燒法是國際上常用 于蛋白質(zhì)含量測定的方法。 樣品燃燒后生成的氮氧化物在鎢上還 原為分子氮，分子氮由二氧化碳載氣運送到TCD熱導檢測器，氮含量引發(fā)一種電子測量信號 , 經(jīng)過標準物質(zhì)獨立校正被測樣 品中氮含量 , 然后轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的含量。 從原理上看 , 如不對樣 品進行預處理 , 該方法與凱氏定氮法同樣也無法區(qū)分蛋白質(zhì)氮 和非蛋白質(zhì)氮。 本研究開發(fā)出一種能夠?qū)θ榧叭橹破分械鞍踪|(zhì)快 速、準確、定量且不受非蛋白質(zhì)氮干擾的蛋白質(zhì)快速檢測儀 8。實驗部分儀器與試劑GDY N-200

4、S蛋白質(zhì)快速檢測儀（長春吉大 小天鵝儀 器XX公司）；Setra BL-120S分析天平（美國西特 Setra公司）； 奶粉中蛋白質(zhì)標物（BW3832-1/ BW3832-2/ BW3832-3購于國家 標準物質(zhì)研究中心； 蛋白質(zhì)試劑 （主成分為偶氮染料 , 長春吉大 小天鵝儀器XX公司）：將蛋白質(zhì)試劑全部轉(zhuǎn)移至2 L蛋白質(zhì)試劑分取器 , 用水稀釋至 2 L, 備用。實驗方法樣品前處理 （ 1 ）牛奶 準確稱取 1.000 g 牛奶于塑 料樣品杯中 , 注入 40 mL 蛋白質(zhì)試劑 , 攪拌 1 min, 以 12000 r/min 離心 3 min, 上清液為待測溶液。（2）奶粉 準確稱取

5、10.000 g 奶粉于塑料樣品杯中 , 加入 90 mL 蒸餾水 , 攪拌 3 min, 此溶 液為奶粉稀釋液。 其它步驟同牛奶蛋白質(zhì)測定步驟。 （ 3）雞蛋 取 2.000 g 攪拌均勻的生雞蛋液 , 加入 1.0 mL 雞蛋蛋白質(zhì)前處理 試劑和7 mL蒸餾水，搖勻，準確稱取0.500 g上述處理后雞蛋 樣品于塑料樣品杯中 , 注入 40 mL 蛋白質(zhì)試劑 , 攪拌 1 min, 分 取攪拌后溶液 , 以 12000 r/min 離心 3 min, 上清液為待測溶液。222測量 以蒸餾水為空白，通過GDYN-200S蛋白質(zhì)快速 檢測儀檢測蛋白質(zhì)試劑反應前后吸光度 , 根據(jù)儀器內(nèi)置數(shù)據(jù)處 理

6、系統(tǒng)計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)快速檢測儀原理和結(jié)構(gòu)儀器的分析原理 將某些有機試劑適量加入到含有蛋白質(zhì)的溶液中時 , 有機試劑與蛋白質(zhì)相互作用生成不溶性化合物 （這些有機試劑可稱為 蛋白質(zhì)試劑） , 離心分離不溶性化合物 , 未與蛋白質(zhì)反應的有機 試劑仍存在溶液中。 通過定量加入的有機試劑 , 借助蛋白質(zhì)快速 檢測儀檢測有機試劑吸光度的變化 , 可測定出樣品中蛋白質(zhì)的 含量。因為溶液吸光度與有機試劑的濃度成正比 , 當?shù)鞍踪|(zhì)存在 時, 溶液中有機試劑濃度降低 , 其溶液吸光度也降低 , 降低程 度與蛋白質(zhì)濃度相關(guān) 9。蛋白質(zhì)快速檢測儀結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)快速檢測儀主要由樣品稱量、 顯色分離和測量 3

7、部分構(gòu)成 , 其中稱量部分由分析天平完成 , 通過數(shù)據(jù)線直接將數(shù)據(jù) 傳輸?shù)紾DYN-200S蛋白質(zhì)快速檢測儀。蛋白質(zhì)檢測儀結(jié)構(gòu)如圖1 所示 , 主要由光源 , 比色池、 檢測器、 硬件驅(qū)動系統(tǒng)和顯示系統(tǒng) 等構(gòu)成。采用中心波長為 483 nm 的超高亮發(fā)光二極管（ LED） 10 作光源 , 該光源又作為單色器 , 使用壽命為 106 h 。與傳統(tǒng)便攜 式分光光度計相比 , 儀器無需光柵和棱鏡等分光器件 , 簡化了 儀器光路系統(tǒng) , 降低成本 , 增加了儀器的抗震和抗干擾能力。 蛋 白質(zhì)試劑在 483 nm 處具有較大摩爾吸光系數(shù) , 如采用傳統(tǒng)的光 程為 1 cm 比色池, 需稀釋后才能測量。

8、為了減少樣品稀釋引起 的測量誤差，該儀器的比色池采用光程僅為2 mm流通式結(jié)構(gòu)，借助注射器實現(xiàn)被測樣品的引入。檢測器為TSL系列集成光頻轉(zhuǎn)換器, 可直接將光信號轉(zhuǎn)化為頻率信號實現(xiàn)光頻數(shù)字化檢測。 微 控制器采用32位ARM AT91SAM7S25作為儀器的邏輯控制核心， 可直接對TSL系列光頻轉(zhuǎn)換器的輸出頻率進行計數(shù),從而得到 透射光的強度值。程序采用ARM匚編與C語言編寫，開發(fā)工具為 GNUarm-elf-toolchain, 嵌入式控制軟件整體流程如圖 2 所示。結(jié)果與討論蛋白質(zhì)試劑光譜圖采用紫外可見分光光度計對蛋白質(zhì)試劑及其與蛋白質(zhì)反應 離心后的上清液進行光譜掃描（圖 3）。從圖 3可見

9、, 蛋白質(zhì)試 劑在 483 nm 處具有較強的特征吸收（曲線 1）。當樣品中蛋白 質(zhì)與試劑發(fā)生特異性反應 , 用紫外可見分光光度計掃描上清液 , 發(fā)現(xiàn)上清液（即未反應的蛋白質(zhì)試劑）在 483 nm 處仍有一個較 強的特征吸收峰 （曲線 2）, 其吸收峰形狀和位置未發(fā)生改變 , 但 吸光度強度明顯降低 , 且隨著蛋白質(zhì)含量的增加其降低程度增 大。同時發(fā)現(xiàn) , 蛋白質(zhì)試劑反應前后吸光度變化值與待測物質(zhì)中 蛋白質(zhì)的含量具有一定關(guān)系 , 即, 其中 , 為蛋白質(zhì)試劑反應前 后吸光度變化值； 為蛋白質(zhì)濃度； 為吸收系數(shù) , 即表示蛋白質(zhì)濃 度變化 1 個單位引起的吸光度值的變化。 據(jù)此, 本研究建立了蛋

10、 白質(zhì)的快速測定方法。檢測儀選用 483 nm 的超高亮發(fā)光二極管 作為光源。溫度對測定結(jié)果的影響 考察了不同溫度對蛋白質(zhì)含量測定的影響。 如表 1 所示, 在 溫度1740 C范圍內(nèi)，溫度對GDYN-200S蛋白質(zhì)快速檢測儀測 定樣品中蛋白質(zhì)（標準值 3.07%）無影響。時間對測定結(jié)果的影響 考察了蛋白質(zhì)試劑與蛋白質(zhì)反應時間對測定結(jié)果的影響 , 結(jié)果表明，在室溫條件下，攪拌1 min樣品中的蛋白質(zhì)可與蛋白 質(zhì)試劑發(fā)生特異性反應； 同時考察蛋白質(zhì)試劑反應后上清液的穩(wěn) 定性，由表2可見，在2 h內(nèi)測定的A和B兩牛奶樣品的蛋白質(zhì) 含量保持不變。整個蛋白質(zhì)測定過程僅需510 min, 與凱氏定氮法

11、23 h 相比, 檢測時間顯著縮短。測定結(jié)果的重復性考察了 GDYN-200S蛋白質(zhì)快速檢測儀對樣品測定結(jié)果的重 復性。對A、B兩牛奶樣品蛋白質(zhì)含量重復測定11次，其測定結(jié) 果的精密度分別為0.9%和0.5%,表明GDYN-200S蛋白質(zhì)快速檢 測儀測定結(jié)果具有良好的精密度。干擾試驗從蛋白質(zhì)檢測儀原理可知 , 檢測信號為蛋白 質(zhì)試劑反應前后吸光度變化值。 向蛋白質(zhì)試劑中添加一定量的三 聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸銨等非蛋白氮物質(zhì) , 以驗證非蛋白 氮是否干擾蛋白質(zhì)的測定 , 結(jié)果如表 3所示。通過紫外 -可見分 光光度計掃描可知 , 三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸銨等添加物 在 483 nm 處均

12、無吸收 , 當加入蛋白質(zhì)試劑時 , 未見不溶性化合 物生成 , 蛋白質(zhì)試劑溶液吸光度也未發(fā)生變化 , 表明三聚氰胺、 尿素、甘氨酸、硝酸銨等未與蛋白質(zhì)試劑反應 , 不影響蛋白質(zhì)的 測定。向鮮奶樣品中添加三聚氰胺 , 結(jié)果如表 4 所示, 當三聚氰 胺添加量w 0.1 g/20 mL時，添加與不添加三聚氰胺對測定結(jié)果 無影響；但添加量過高時 , 蛋白質(zhì)測定結(jié)果偏低 , 這是因為隨著 三聚氰胺添加量的逐漸增加 , 蛋白質(zhì)在添加了三聚氰胺的樣品 中的質(zhì)量分數(shù)逐漸降低所致。蛋白質(zhì)快速檢測儀的應用將研制的GDYN-200SS白質(zhì)快速檢測儀應用到新鮮乳、 市售 純牛奶、牛奶飲料 （核桃、 燕麥、紅棗）、奶

13、粉（包括牛初乳粉） 、 豆?jié){粉、豆奶粉和雞蛋等 500 個樣品中蛋白質(zhì)的定量測定 , 并與 凱氏定氮法進行比較 , 同時測定了 3 種奶粉中蛋白質(zhì)標準物質(zhì) , 部分結(jié)果見表 5 所示。從檢測數(shù)據(jù)可知 , 與凱氏定氮法測定結(jié)果（依據(jù)國家標準方法 1,7 分別測定樣品中的總氮和非蛋白氮 , 二者差減后計算出樣品中真實的蛋白質(zhì)含量）與標準物質(zhì)相比 , 其相對誤差均小于 5%。從實驗結(jié)果可知 , 蛋白質(zhì)試劑可快速定量與樣品中蛋白質(zhì) 發(fā)生反應（ 1 min ） , 且能穩(wěn)定 2 h, 單一樣品全程檢測周期僅 需510 min ;因蛋白質(zhì)試劑僅與蛋白質(zhì)氮特異性反應，避免了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸銨等非

14、蛋白氮的干擾；同時該儀 器和方法操作簡單 , 避免了傳統(tǒng)檢測方法消解、 蒸餾和滴定等復 雜步驟 , 適用于實際樣品中的蛋白質(zhì)定量檢測。ReferencesGB/T 5009.5-2010, Determination of Protein in Foods （食品中蛋白質(zhì)的測定） . National Standards of thePeople s Republic of China（中華人民共和國國家標準）GB/T 5410-2008, Milk Powe（r 乳粉）. National Standardsof the Peoples Republic of China（中華人民共和國國家

15、標準）ISO 14891/IDF 185: 2002 Milk and Milk Products-Determination of Nitrogen Content-Routine Method Using Combustion According to the Dumas PrincipleMarco A, Rubio R, CompanoR, Casals I. Talanta, 2002, 57: 1019 1026Saint-Denis T, Goupy J. Analytica Chimica Acta, 2004,515: 191 198ISO 8968-4/IDF 20-4:

16、2001 Milk-Determination ofNitrogen Content Part 4: Determination ofNon-protein-nitrogen ContentGB/T 21704-2008, Determination ofNon-protein-nitrogen Content in Milk and Dairy Products （乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定） . National Standards of the People s Republic of China（中華人民共和國國家標準）YU Ai-Min, WANG Zhen-De （于愛民 ,

17、王振德） . China Patent （中國專利） , ZL200820209752.9WANGing-Yan, ZHUSheng-Geng, XUChang-Fa （王鏡巖， 朱圣庚 , 徐長法） . Biochemistry （生物化學） Beijing （北 京） : Higher Education Press （高等教育出版社） , 2002: 300YU Ai-Min, WANG Zhen-De （于愛民 , 王振德） . ChinaPatent （中國專利） , ZL200720003016.3Fast Determination of Protein in Milk and

18、DairyProducts Using Protein Fast AnalyzerFENGXu-Dong1, AN Wei-Dong2, DINGYi1, YUAi-Min1, LIU Jing3,GAO De-Jiang3, WANG Zhi-Hong4, YU Yong41（College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130012）2( Jilin Institute of Metrology, Changchun 1300223(Changchun Jilin University-Little SwanInstruments Co

19、., Ltd., Changchun 130012 )4( College of Instrumentation & Electrical Engineering, Jilin University, Changchun 130012 )A rapid analyzer for the determination of protein were developed. The effects of experimental parameters, including temperature, time, and foreign substances were investigated. Several milk and dairy products were analyzed using the protein fast analyzer. The exp