輻照食品的鑒定 篩選法 標(biāo)準(zhǔn)文本（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)）

1、食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)輻照食品的鑒定 篩選法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定三種可快速篩選食品是否接受過輻照的鑒定方法：光釋光法，DNA彗星法和微生物學(xué)篩選法。光釋光法適用于對貝類、中草藥、香辛料和調(diào)味品類產(chǎn)品進(jìn)行快速判定。DNA彗星試驗法適用于對生鮮肉類、原糧、干果、蔬菜及香辛料產(chǎn)品進(jìn)行快速判定。微生物學(xué)篩選法適用于對冷凍畜禽肉和水產(chǎn)品等各類生鮮食品進(jìn)行快速判定。本標(biāo)準(zhǔn)方法便于對輻照食品進(jìn)行快速篩查，但是存在一定的誤檢率。要最終確定可疑物是否接受了輻照，需要配合其他檢測標(biāo)準(zhǔn)對食品進(jìn)行檢測。第一法 光釋光法2 術(shù)語和定義2.1 光釋光 photostimulated luminescence （PSL）樣品俘獲的

2、輻射能量經(jīng)光激發(fā)后，以光的形式釋放出來的現(xiàn)象。2.2 PSL強度（PSL intensity）樣品經(jīng)光激發(fā)后檢測到的發(fā)光量，以光子計數(shù)率表示。2.3 篩查PSL（screening PSL）樣品初次測量的PSL強度。2.4 校正PSL（calibrated PSL）初始PSL測量之后，同一樣品用已知劑量輻照后測量的PSL強度。2.5 閾值（thresholds）在篩查模式下，用于樣品輻照與否判定的PSL強度，包括一個低閾值（T1）和一個高閾值（T2）。2.6 陰性PSL結(jié)果（negative PSL result）PSL強度低于低閾值。2.7 中間PSL結(jié)果（intermediate PSL

3、result）PSL強度在低閾值和高閾值之間。2.8 陽性PSL結(jié)果（positive PSL result）PSL強度高于高閾值。2.9 黑暗計數(shù)（dark count）無光刺激時，對空樣品容器獲得的光子計數(shù)率。2.10 光計數(shù)（light count）將參考光源（XX裝有14C的閃爍體或者等效物）置于樣品容器中得到的光子計數(shù)率。3 原理中草藥、香辛料和調(diào)味品中的硅酸鹽，貝殼或者甲殼類動物外殼中的方解石以及骨或牙齒中的羥磷灰石在生物界中廣泛存在。這些物質(zhì)接受輻射照射后，能夠儲存射線的能量。通過光刺激含有這些物質(zhì)的食品樣品，可以釋放出其中儲存的能量，進(jìn)而產(chǎn)生光釋光信號。利用光釋光檢測儀記錄的光

4、子數(shù)反映出光釋光信號的強度。采用比較光子數(shù)閾值的方法可以實現(xiàn)對樣品輻照與否的判定。光釋光法不會破壞樣品，因此待檢樣品可以進(jìn)行反復(fù)多次測量。該方法適于對輻照食品進(jìn)行快速篩查。4 儀器和設(shè)備4.1 PSL測量系統(tǒng)：包括樣品容器、光激發(fā)源、脈沖刺激儀和同步光子計數(shù)系統(tǒng)。4.2 測量盤：直徑5 cm。4.3 輻射源5 分析步驟5.1 總則 樣品在加樣前和測量時應(yīng)在弱光下放置。測量時使用一次性的測量盤。5.2 中草藥、香辛料和調(diào)味品的樣品制備 將樣品均勻鋪在測量盤底部，形成一定的厚度層，備雙份，分別檢測。如果兩次檢測結(jié)果與判定閾值相比不一致，則將樣品4等分后重新進(jìn)行檢測，取其中最高的兩個檢測值作為結(jié)果進(jìn)

5、行判定，依此類推。5.3 甲殼類動物的樣品制備 將帶殼樣品或去殼樣品放入測量盤中，盡量保證腸子部位朝上放置。如個體較大，應(yīng)該適當(dāng)對樣品進(jìn)行切割以適合測量盤的尺寸；也可以直接取甲殼類動物的腸子（不少于6根）放入測量盤中進(jìn)行測量。5.4 儀器設(shè)置設(shè)定輻照食品篩查系統(tǒng)的個體測量參數(shù)（循環(huán)時間、閾值和數(shù)據(jù)記錄條件）。儀器設(shè)置過程中需要檢查黑暗計數(shù)和光計數(shù)。香料和草藥的閾值設(shè)定為：T1=700計數(shù)/min，T2=5000計數(shù)/min。甲殼類動物的閾值設(shè)定為：T1=1000計數(shù)/min，T2=4000計數(shù)/min。應(yīng)當(dāng)定期或者當(dāng)樣品中出現(xiàn)陽性結(jié)果后對容器進(jìn)行空樣品運行檢測，以保證容器未受樣品污染。5.5

6、樣品測定5.5.1 篩查測量進(jìn)行樣品檢測并記錄結(jié)果。按照2.6 2.8中預(yù)先設(shè)定的閾值，對篩查結(jié)果分類。5.5.2 校正測量篩查檢測后的樣品應(yīng)加蓋保存，以防止樣品損失或污染，且應(yīng)避免劇烈晃動。對這些樣品再給予特定劑量（香辛料和貝類食物給予1 kGy）的輻照后，室溫（甲殼類動物和其他易腐爛樣品應(yīng)冷藏）避光保存過夜，然后根據(jù)5.5.1相同的條件對樣品進(jìn)行校正測量。6 結(jié)果判定表述6.1 陰性結(jié)果6.1.1 篩查PSL陰性篩查結(jié)果可判定樣品未經(jīng)輻照。但是某些PSL敏感度低的輻照樣品也可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。6.1.2 校正PSL校正結(jié)果和篩查結(jié)果同為陰性時，該樣品不能被判定為輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是

7、否接受過輻照，需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法。校正結(jié)果為陰性，但篩查結(jié)果為陽性時，表明測量系統(tǒng)有錯誤，應(yīng)當(dāng)取新鮮的原始樣品重新測量。6.2 中間結(jié)果6.2.1 篩查PSL中間篩查結(jié)果不能直接判定樣品是否接受過輻照。6.2.2 校正PSL校正PSL和篩查PSL同為中間結(jié)果時，判定樣品接受過輻照。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為陰性結(jié)果時，表明樣品可能是低敏感性未輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是否接受過輻照，需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為高數(shù)值陽性結(jié)果時，表明測量有誤。校正PSL為中間結(jié)果，篩查PSL為接近T2的陽性結(jié)果時

8、，表明樣品可能接受過高于校正劑量的輻照。應(yīng)當(dāng)重新測量樣品進(jìn)行判定。6.3 陽性結(jié)果6.3.1 篩查PSL陽性篩查結(jié)果可判定樣品接受過輻照。但有些PSL靈敏度高的非輻照樣品也可能產(chǎn)生陽性結(jié)果。6.3.2 校正PSL校正PSL和篩查PSL為同級別的陽性結(jié)果時，判定樣品接受過輻照。校正PSL為陽性結(jié)果，且遠(yuǎn)高于陰性或中間結(jié)果的篩查PSL時，表明樣品可能未經(jīng)輻照。校正PSL和篩查PSL為陽性結(jié)果，但校正PSL小于篩查PSL時（相差1到2個數(shù)量級），表明測量有誤，需要重新進(jìn)行測量。7 限制性理論上，光釋光法適用于對任何含有礦物質(zhì)的輻照食品進(jìn)行判定。樣品的PSL強度依賴于樣品中的礦物質(zhì)含量和種類。某些低敏

9、感性的輻照物質(zhì)可能產(chǎn)生低PSL信號。校正法有利于區(qū)別以上情況。如果在校正之后，樣品的PSL強度為陰性結(jié)果或中間結(jié)果，則需要參考“熱釋光法”和“電子自旋共振波譜法”等方法進(jìn)行判定。樣品由多種物質(zhì)混合而成時，由于各物質(zhì)具有不同的PSL敏感度，所以可能對樣品的校正PSL測量結(jié)果產(chǎn)生影響。輻照樣品中若存在食鹽等結(jié)晶物，樣品更易被光釋光法鑒定出來。第二法 DNA彗星試驗法 8 術(shù)語和定義DNA彗星試驗（DNA comet assay）：一種將電泳、顯微呈像和光度分析等多重技術(shù)相結(jié)合的，在單細(xì)胞水平進(jìn)行DNA鏈斷裂損傷檢測的方法，具有簡便、靈敏、快捷、重復(fù)性好、樣品用量小等優(yōu)點。9 原理含有DNA的食品經(jīng)

10、過輻照處理后，DNA分子會發(fā)生變化，包括DNA單鏈或者雙鏈的斷裂。將這些細(xì)胞包埋在瓊脂中，采用裂解試劑溶解細(xì)胞膜，然后在一定的電壓下進(jìn)行電泳。受損的DNA片段由于分子質(zhì)量較小，在電場中向陽極方向快速移動，并形成尾狀分布。染料染色后，DNA受損的細(xì)胞就會出現(xiàn)彗星狀電泳圖譜，未受輻射的細(xì)胞的圖譜接近圓形或者輕微拖尾。DNA彗星試驗法是一種快速的樣品輻照篩查方法，其工作原理基于樣品中DNA的損傷。由于其他的食品加工處理方法也會導(dǎo)致DNA損傷，所以這種方法只能間接判定樣品可能接受了輻照。要最終確定可疑物是否接受了輻照，需要配合其他檢測標(biāo)準(zhǔn)對食品進(jìn)行檢測。10 試劑注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分

11、析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。10.1 二甲基亞砜（DMSO）10.2 氯化鈉（NaCl）10.3 氯化鉀（KCl）10.4 磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）10.5 磷酸二氫鉀（KH2PO4）10.6 瓊脂糖10.7 低熔點瓊脂糖10.8 乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）10.9 氫氧化鈉（NaOH）10.10 Tris10.11 硼酸（H3BO3）10.12 十二烷基磺酸鈉（SDS）10.13 吖啶橙10.14 磺化吡啶10.15 溴化乙錠10.16 三氯乙酸（TCA）10.17 硫酸鋅（ZnSO4）10.18 甘油（C3H8O3）10.19 碳酸鈉（Na2CO3）10

12、.20 硝酸銨（NH4NO3）10.21 硝酸銀（AgNO3）10.22 鎢硅酸10.23 甲醛（CH2O）10.24 冰醋酸（CH3COOH）11 儀器和設(shè)備11.1 水平電泳槽11.2 天平：精確至0.001g11.3 電加熱磁力攪拌器11.4 微波爐11.5 微孔濾膜：孔徑100m、200m、500m。11.6 顯微鏡載玻片：（7626）mm，帶磨砂邊。11.7 熒光顯微鏡： 100 400倍；藍(lán)色激發(fā)波長460 nm 485 nm，用于吖啶橙染色觀察；綠色激發(fā)波長515 nm 560 nm，用于磺化吡啶或溴化乙錠染色觀察。12 分析步驟12.1 樣品制備12.1.1 動物組織1）骨髓樣

13、品的制備。切開骨頭，稱取約50 mg骨髓置于試管中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。玻璃棒將細(xì)胞懸起，用100 m的微孔濾膜過濾細(xì)胞懸液，將濾液置于冰上，待進(jìn)一步分析（細(xì)胞懸液可置于冰上放置，時間不超過10 min；在加入5% 10%的DMSO作為防凍劑后，細(xì)胞可置于-20保存26 h）。2）肌肉組織樣品制備。刮取肌肉組織，或用解剖刀將肌肉組織切成薄片（不能有可見脂肪）。稱取1 g肌肉置于小燒杯中，加入5 mL冰預(yù)冷的PBS。將該小燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過濾，冰上放置5 min，取上清液待用。12.1.2 植物組織1）原糧、堅果和調(diào)

14、味料等食品。稱取樣品0.25 g，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。2）草莓等漿果。采摘草莓漿果，或用水沖下草莓漿果的混合物。稱取0.25 g漿果，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。3）蔬菜（不包括食用菌）。將蔬菜的可食組織用解剖刀切成薄片，取4

15、g置于小燒杯中，加入5 ml冰預(yù)冷的PBS，用研缽碾碎，置于小燒杯中，加入3 mL冰預(yù)冷的PBS。將該小燒杯置于冰盒中，500 r/min攪拌5 min，依次用500 m和200 m的微孔濾膜過濾，冰上放置15 min 60 min，取上清液作進(jìn)一步分析。 12.2 預(yù)涂載玻片涂布前，載玻片應(yīng)用甲醇浸泡過夜以除去表面的油脂，風(fēng)干。滴一滴（約50 L）涂層瓊脂糖溶液于載玻片上，立即取另一個載玻片蓋在瓊脂糖上，使瓊脂糖溶液散開，取下上層載玻片，風(fēng)干30 min。預(yù)涂載玻片可置于干凈無塵環(huán)境中保存幾周。12.3 包埋凝膠取100 L細(xì)胞懸液與1 mL包埋凝膠溶液混勻，然后取100 L該混合液用槍頭輕

16、輕涂布在預(yù)涂載玻片上，立即蓋上蓋玻片使凝膠鋪展均勻，注意不要產(chǎn)生氣泡。將載玻片置于冰上5 min，然后用解剖刀尖將蓋玻片從瓊脂糖上剝離。12.4 溶解細(xì)胞將6.3制備的載玻片完全浸入裂解緩沖液中（動物細(xì)胞至少5 min，植物細(xì)胞至少15 min），使細(xì)胞溶解，整個過程不要碰到瓊脂糖。12.5 回濕將細(xì)胞已溶解的載玻片浸入電泳緩沖液中5 min。12.6 電泳將載玻片并排放入水平電泳槽，磨砂邊緣朝向陰極。電泳槽中加入電泳緩沖液沒過載玻片2 mm 4 mm。室溫下電泳20 min，電壓2 V/cm。關(guān)閉電源后，將載玻片放入水中5 min，室溫下風(fēng)干1 h。 12.7 染色1）吖啶橙染色。將載玻片浸

17、入吖啶橙染色液3 min 5 min，然后浸入水中清洗0.5 min 1 min，擦干載玻片下多余的水分，熒光顯微鏡觀察。2）磺化吡啶染色。將載玻片浸入磺化吡啶染色液3 min 5 min，后續(xù)步驟同吖啶橙染色。3）溴化乙錠染色。步驟同磺化吡啶染色。4）硝酸銀染色。將載玻片置于混合液A 10 min，水洗1 min，40 50恒溫干燥箱干燥1 h或室溫風(fēng)干。然后將載玻片浸入混合液D 10 min 20 min，重復(fù)該步驟1 2次，染色時間5 min 10 min，直至載玻片呈現(xiàn)棕色。水洗1 min，用停止液E浸泡5 min停止染色反應(yīng)，再水洗1 min。最后將載玻片室溫放置，自然風(fēng)干。染色后的

18、載玻片不會褪色，可長期保存觀察。注：熒光染料易淬滅，染色及觀察要迅速；染色液有毒，實驗結(jié)束后，應(yīng)對廢液進(jìn)行凈化處理再行棄置。12.8 觀察鑒別12.8.1 熒光觀察吖啶橙染色的載玻片必須用熒光顯微鏡（460 nm 485 nm，藍(lán)光激發(fā)）觀察，染色DNA發(fā)出綠色熒光?；腔拎せ蜾寤义V染色的載玻片必須用熒光顯微鏡（515 nm 560 nm，綠色激發(fā)）配合590 nm濾光片觀察，染色DNA發(fā)出紅色熒光。12.8.2 白光觀察硝酸銀染色的載玻片可使用普通顯微鏡觀察。13 判XX果的表述輻照過的樣品幾乎沒有完整細(xì)胞，全部是彗星圖像（圖B.1和圖B.2）；未受損的細(xì)胞不拖尾或者有輕拖尾（圖B.3）.

19、通過顯微鏡觀察，未出現(xiàn)彗星圖像時，結(jié)果報告為陰性；出現(xiàn)彗星圖像的結(jié)果為陽性，陽性結(jié)果應(yīng)該依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確證。14 限制性理論上，DNA彗星試驗法適用于所有含有DNA的輻照食品。實際上不同樣品產(chǎn)生的彗星形狀可能有明顯差異，而且其他的處理過程也可能影響DNA形態(tài)，這在一定程度上給輻照食品的判定帶來困難。所以DNA彗星試驗法只能作為一種輻照食品的快速篩查辦法，判XX果需要經(jīng)過其他的標(biāo)準(zhǔn)方法確認(rèn)。任何一種新食品在用該方法進(jìn)行測定時，需要對操作過程的各個條件，特別是對細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行摸索和確認(rèn)，以期得到理想的電泳圖譜。第三法 微生物學(xué)篩選法 15 術(shù)語和定義15.1 革蘭氏陰性菌（Gram nega

20、tive bacteria）用革蘭氏染色法染色后呈紅色或黃色的細(xì)菌，如大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌等。15.2 內(nèi)毒素（endotoxin）革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的特有成分。只有在細(xì)菌裂解后，內(nèi)毒素才會釋放出來，可引起宿主發(fā)熱和內(nèi)毒素休克等癥狀。16 原理內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上特有成分。食品經(jīng)過一定劑量的輻照處理后，食品中的革蘭氏陰性細(xì)菌基本上會被殺死，但是所殘留的內(nèi)毒素不會因為輻照處理而消失。因此可以通過內(nèi)毒素濃度測定計算食品中被殺死和未被殺死的革蘭氏陰性細(xì)菌的總數(shù)，同時對食品中活的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)，兩者的差異比較可以判斷食品是否經(jīng)過輻照處理。若兩個

21、數(shù)值的差異很大，表明樣品可能接受過輻照。17 試劑和材料17.1 試劑17.1.1 鱟試劑：靈敏度0.5 EU/mL 17.1.2 注射用無內(nèi)毒素水17.2 材料17.2.1 蛋白胨溶液（見附錄C.1）17.2.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（見附錄C.2）17.2.3 牛奶瓊脂培養(yǎng)基（見附錄C.3.1）17.2.4 結(jié)晶紫溶液（見附錄C.3.2）17.2.5 青霉素溶液（見附錄C.3.3）17.2.6 革蘭氏陰性細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基（見附錄C.3.4）17.3 標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度99%。17.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入無內(nèi)毒素水溶解為50 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。18 儀器和

22、設(shè)備18.1 可調(diào)溫水浴鍋18.2 高壓滅菌鍋18.3 分析天平：感量0.001g。18.4 恒溫干燥箱18.5 渦旋振蕩器18.6 電熱恒溫培養(yǎng)箱18.7 均質(zhì)器：8000 r/min 10000 r/min。18.8 微量移液器：20 L 200 L，100 L 1000 L。19 分析步驟19.1 樣品的儲存和運送樣品應(yīng)該在4保存，24 h內(nèi)送往實驗室檢驗。如不能立即檢驗，應(yīng)置于-20保存，最長保存時間不超過30 d。19.2 制樣無菌條件下于樣品的不同部位取樣，共取10 g樣品，置于無菌塑料容器中，用一次性針筒加入90 mL無內(nèi)毒素水。8000 r/min均質(zhì)1 min 2 min，制

23、成10-1樣品溶液，4保存?zhèn)溆?，最長保存時間不超過24 h。19.3 革蘭氏陰性細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)19.3.1 培養(yǎng)基制備制備蛋白胨溶液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基（參見附錄C），傾注平板前將融化的培養(yǎng)基于45 1 水浴保溫。19.3.2 接種和培養(yǎng)1）根據(jù)樣品污染情況，對樣品溶液（10-1）作進(jìn)一步的稀釋，用蛋白胨溶液對樣品稀釋液按照9mL 比1mL的體積比進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-2 10-5樣品稀釋液。2）將0.1 mL的不同稀釋度的樣品稀釋液涂布在瓊脂營養(yǎng)板上，于20 25 下靜置90 min。每個稀釋度做兩個平板。3）每個平板覆蓋10 mL革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基，樣液與

24、培養(yǎng)基充分混合。水平放置，使瓊脂凝固。倒置平板于211培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h1 h。4）選擇菌落數(shù)為15 300的2個連續(xù)稀釋度平板計數(shù)。按式（1）計算每克樣品中的革蘭氏陰性菌數(shù)：N=c式中：N每克樣品中革蘭氏陰性細(xì)菌數(shù)（CFU/g）；c長有15 300菌落的2個連續(xù)稀釋度平板的菌落之和；V每個平板接種的菌液體積（mL）；n1第一個稀釋度的計數(shù)平板數(shù)；n2第二個稀釋度的計數(shù)平板數(shù)；d計數(shù)有效平板的第一個稀釋度。若只有一個稀釋度的平板長有15 300個菌落時，則n2計為0（見附錄D表D.1的例2）。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15時，則以菌落數(shù)最多的平板的菌落數(shù)作為N值的估計值（見附錄D表D.1

25、的例3）。若所有稀釋度的平板菌落均未長菌時，結(jié)果表示為未檢測到革蘭氏陰性菌，N值計為0（見附錄D表D.1的例4）。19.4 內(nèi)毒素檢測19.4.1 檢測原理在適宜條件下，細(xì)菌內(nèi)毒素可激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。內(nèi)毒素與革蘭氏陰性菌含量呈線性關(guān)系，所以可以根據(jù)內(nèi)毒素的含量測定革蘭氏陰性菌的污染程度。19.4.2 鱟試劑檢測使用吸附有鱟測試劑的標(biāo)準(zhǔn)96孔板測定內(nèi)毒素濃度，樣品稀釋孔和鱟試劑測試孔交替排布，每一個樣品稀釋孔中加入65 L不含內(nèi)毒素的水。取30 L樣品懸浮溶液加入到第一個樣品稀釋孔中，混合均勻，得到10-0.5樣品稀釋液。將10-0.5樣品稀釋液30 L加入到

26、第一個測試孔中，同時將10-0.5樣品稀釋液30 L加入到第二個樣品稀釋孔中，得到10-1樣品稀釋液。再將10-1樣品稀釋液30 L加入到第二個測試孔中，同時將10-1樣品稀釋液30 L加入到第三個樣品稀釋孔中，得到10-1.5樣品稀釋液。一直稀釋并檢測，直到豎排的8個測試孔中全部加入檢測樣品為止（見附錄D圖D.1）。蓋上96孔板蓋子，置于370.5水浴中反應(yīng)1 h。注：每一個96孔板上應(yīng)該包括一個陽性對照和一個陰性對照。陽性對照由試劑盒附帶的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品配制，初始濃度為50 EU/mL。陰性對照是不含內(nèi)毒素的水。19.4.3 結(jié)果計數(shù)當(dāng)試劑發(fā)生完全凝集時記為“”，部分凝集時記為“”，未凝集

27、時記為“”。19.4.4 內(nèi)毒素定量根據(jù)不同稀釋倍數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測情況確定檢測鱟試劑的靈敏度。以發(fā)生凝固的最后一個樣品稀釋溶液的滴度用于計算，如果完全凝固時，以實際滴度用于計算，如果為部分凝固“”時，則以該倍數(shù)的指數(shù)減去0.25后作為滴度值用于計算。按式（2）計算每克樣品中內(nèi)毒素含量。LAL= 10t10s（2）式中：LAL每克樣品中內(nèi)毒素含量，EU/g； t樣品的滴度值； s標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的靈敏度。20 判XX果表述1）計算log10LAL、log10N和log10LAL - log10N值。2）當(dāng)樣品經(jīng)檢測含有較高的內(nèi)毒素含量，但經(jīng)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較少或者未檢測出有可培養(yǎng)的革蘭氏

28、陰性菌，即經(jīng)計算log10LAL - log10N值大于0，判定該樣品可能經(jīng)過輻照處理。3）若樣品經(jīng)檢測含有較高的內(nèi)毒素含量，且培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較多，即經(jīng)計算log10LAL - log10N值小于或等于0，判定該樣品未經(jīng)過輻照處理。4）當(dāng)樣品中內(nèi)毒素含量較低（log10LAL2），并且經(jīng)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較少（log10N2），不可判定樣品是否經(jīng)過輻照處理。21 限制性該方法只能判定樣品可能接受過輻照，要最終確認(rèn)樣品是否接受過輻照，需要參考其他的輻照食品測定方法進(jìn)行測定。食品的冷凍會造成微生物的大量死亡，所以會降低革蘭氏陰性菌的計算值；而輻照食品在室溫放置時有利于微生物的重新生長，

29、所以會提高革蘭氏陰性菌的計算值，這些都會影響最終的判XX果。所以應(yīng)用該方法時盡量對新鮮樣品及時檢測。附錄A（資料性附錄）試劑配制A.1 鹽酸（1 mol/L）量取90 mL鹽酸，加適量水稀釋到1000 mL。A.2 PBS緩沖液（pH7.4）稱取8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、2.94 g十二水合磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀溶于900 mL水中，混合均勻，用鹽酸（A.1）調(diào)pH=7.4，然后定容到1000 mL，高壓滅菌后備用。A.3 涂層瓊脂糖溶液（0.5%）10 mL蒸餾水中加入50 mg瓊脂糖，加熱或微波煮沸，45水浴待用。A.4 包埋凝膠溶液（0.8%）10 mLPBS（A.

30、2）中加入80 mg低熔點瓊脂糖，加熱或微波煮沸，45水浴待用。A.5 氫氧化鈉溶液（40%）稱取40 g氫氧化鈉，溶于60 mL水中。A.6 EDTA儲存液（0.5 mL/L）稱取93.05 g乙二胺四乙酸二鈉溶于300 mL水中，混合均勻，用氫氧化鈉溶液（A.5）調(diào)pH=8.0，然后定容至500 mL，高壓滅菌后備用。A.7 TBE貯存液稱取54 g Tris和27.5 g硼酸溶于20 mL EDTA貯存液（A.6），用水稀釋至1000 mL。該TBE貯存液置于玻璃瓶中，室溫保存。使用時若有沉淀，應(yīng)重新配置。A.8 電泳緩沖液準(zhǔn)確量取10 mL TBE貯存液（A.7）和90 mL水，調(diào)ph

31、=8.4，混合后備用。A.9 裂解緩沖液稱取25 g十二烷基磺酸鈉用電泳緩沖液稀釋至1000 mL，混勻后備用。A.10 熒光染色試劑A.10.1 吖啶橙貯存液稱取100 mg吖啶橙溶于100 mL水中，4 6避光保存。A.10.2 吖啶橙染色液量取0.5 mL吖啶橙貯存液（A.10.1），用PBS緩沖液（A.2）稀釋至100 mL，4 6可保存一周。A.10.3 磺化吡啶貯存液稱取100 mg磺化吡啶溶于100 mL水中，4 6避光保存。A.10.4 磺化吡啶染色液量取1 mL 5 mL磺化吡啶貯存液（A.10.3），用PBS緩沖液（A.2）稀釋至100 mL，混勻后備用。A.10.5 溴化

32、乙錠貯存液稱取1 g溴化乙錠溶于100 mL水中，轉(zhuǎn)移至棕色瓶或鋁箔包裹容器中，室溫避光保存。A.10.6 溴化乙錠染色液量取2 mL溴化乙錠貯存液（A.10.5），用水稀釋至100 mL，混勻后備用。A.11 銀染試劑A.11.1 混合液A準(zhǔn)確稱取150 g三氯乙酸，50 g硫酸鋅，50 g甘油，用水溶解并稀釋到1000 mL，混勻后備用。A.11.2 染色液B準(zhǔn)確稱取12.5 g碳酸鈉，用水溶解并稀釋至250 mL，混勻后備用。A.11.3 染色液C準(zhǔn)確稱取100 mg硝酸銨，100 mg硝酸銀，500 mg鎢硅酸溶于水，加入250 L甲醛（37%），水用稀釋至500 mL，混勻后備用。A.11.4 染色液D準(zhǔn)確量取68 mL 染色液C加入到32 mL染色液B中，加液同時要不斷用力攪拌混合液。染色液D應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。A.11.5 停止液E準(zhǔn)確量取10 mL冰醋酸，加水稀釋至1000 mL。附錄B（資料性附錄）DNA彗星試驗圖譜（輻照劑量5 kGy，溴化乙錠染色，放大倍數(shù)150倍）圖B.1 輻照動物組織細(xì)胞電泳圖（輻照劑量5 kGy，溴化乙錠染色，放大倍數(shù)200倍）圖B.2 輻照植物組織細(xì)胞電泳圖（輻照劑量0 kGy，溴化乙錠染色，放