膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件

1、膠原樣凝集素幻燈免疫膠原樣凝集素幻燈免疫一、凝集素（LECTIN）的分類C-型凝集素: 需要Ca2+維持活性的凝集素S-型凝集素: 巰基依賴或-半乳糖結(jié)合的凝集素一、凝集素（LECTIN）的分類二、膠原樣凝集素歷史上的重要發(fā)現(xiàn)1906 conglutinin; first animal lectin to be associated with the immune system1989-1991 mannan-binding lectin1999 collectin liver 1(CL-L1)2001 collectin placenta 1(CL-P1)2003 collectin kid

2、ney 1(CL-K1)二、膠原樣凝集素歷史上的重要發(fā)現(xiàn)1906 conglut三、膠原樣凝集素的一般特性三、膠原樣凝集素的一般特性四、膠原樣凝集素的結(jié)構(gòu)（一）一級結(jié)構(gòu)特點1. N端富含半胱氨酸區(qū)段：7-28氨基酸，其中1-3半胱氨酸2. 膠原樣區(qū)：53-177氨基酸(-Gly-Xaa-Yaa-)n重復序列, Xaa、Yaa多為脯aa或羥脯aa3. 頸區(qū)：24-28氨基酸，-helice coiled-coils4. 糖識別區(qū)（CRDs）：與相應的糖配體結(jié)合四、膠原樣凝集素的結(jié)構(gòu)（一）一級結(jié)構(gòu)特點膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件(二)三級結(jié)構(gòu)1.同源三聚體的形成(亞單位) 相同的三條肽鏈形成類似郁

3、金香花朵2.亞單位進一步聚集成寡聚體 單體CL-43, CL-L1 四聚體SP-D, Conglutinin, CL-46(十字形結(jié)構(gòu)) 六聚體SP-A, MBL (一束郁金香花)(二)三級結(jié)構(gòu)1.同源三聚體的形成(亞單位)膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件(三)糖結(jié)合特異性 膠原樣凝集素的凝集素樣活性存在于CRDs, 由三個氨基酸基序決定: 1.甘露糖結(jié)合基序: Glu-Pro-Asn 2.半乳糖結(jié)合基序: Gln-Pro-Asp 所有膠原凝樣集素(SP-A除外)均具有甘露糖特異基序Glu-Pro-Asn, SP-A第三位的氨基酸由Arg(狗)或Ala替換Asn.(三)糖結(jié)合特異性 膠原樣凝集素的

4、凝集素樣活性存在于CR膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件所有膠原凝樣集素(SP-A除外)均具有甘露糖特異基序Glu-Pro-Asn, SP-A第三位的氨基酸由Arg(狗)或Ala替換Asn.單體CL-43, CL-L1等克隆和鑒定出一個編碼新的膠原凝集素基因，稱肝臟膠原凝集素1（collectin liver 1， CL-L1），該基因定位于第八號染色體的長臂上，其基因結(jié)構(gòu)由6個外顯子（EX1EX6）和5個內(nèi)含子（IN1IN5）組成，cDNA含有831bp插入片段，編碼277個氨基酸殘基。2GXY+NECK+CRDkkkk(4)Induce expression by adding IPTG to

5、a final concentration 1 mM.(四)抑制微生物的生長collectin直接作為調(diào)理素induction 3 hrs通過橋聯(lián)，可使病原微生物凝集成大塊，加強呼吸道黏膜纖毛清除作用，阻止病原吸附到細胞表面，抑制其定居和侵入，促進吞噬作用。推測的氨基酸序列具有典型的膠原凝集素結(jié)構(gòu)：N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸部和糖識別區(qū)。所有膠原凝樣集素(SP-A除外)均具有甘露糖特異基序Glu-系統(tǒng)樹系統(tǒng)樹(五)結(jié)合微生物種類(五)結(jié)合微生物種類五、膠原樣凝集素在宿主防御方面的生物學功能（一）凝集作用 通過橋聯(lián)，可使病原微生物凝集成大塊，加強呼吸道黏膜纖毛清除作用，阻止病原吸附到細胞表

6、面，抑制其定居和侵入，促進吞噬作用。五、膠原樣凝集素在宿主防御方面的生物學功能（一）凝集作用（二）補體激活作用 1. MBL產(chǎn)生 病原微生物感染早期 刺激激活 巨噬細胞和中性粒細胞 TNF-,IL-1,IL-6 急性期反應 肝細胞 MBL, CRP 2.MBL途徑(lectin pathway) MBL與病原微生物表面的mannose, fucose, GlcNAc結(jié)合啟動的補體激活級聯(lián)反應 （二）補體激活作用膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件(三)調(diào)理作用 1.collectin的受體 見下表 2.collectin直接作為調(diào)理素 3.激活補

7、體成分 C4b, C3b, iC3b 4.吞噬作用的激活(三)調(diào)理作用膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件(四)抑制微生物的生長 SP-A,SP-D直接引起微生物細胞壁通透性增強,導致微生物生長抑制或死亡(五)調(diào)節(jié)炎癥反應 調(diào)節(jié)前炎癥因子的合成分泌(四)抑制微生物的生長(六)調(diào)節(jié)特異性免疫 DCs抗原提呈, DCs成熟, T細胞增殖(七)調(diào)節(jié)過敏反應 SP-A,SP-D抑制IgE與過敏原結(jié)合, 抑制過敏早期組織胺釋放, 抑制晚期支氣管炎癥中淋巴細胞增殖(六)調(diào)節(jié)特異性免疫(八)對細胞凋亡的影響 SP-A抑制型肺泡細胞凋亡, SP-A、SP-D,、MBL刺激凋亡細胞清除(八)

8、對細胞凋亡的影響Human CL-L1的研究1999年Ohtani k.等克隆和鑒定出一個編碼新的膠原凝集素基因，稱肝臟膠原凝集素1（collectin liver 1， CL-L1），該基因定位于第八號染色體的長臂上，其基因結(jié)構(gòu)由6個外顯子（EX1EX6）和5個內(nèi)含子（IN1IN5）組成，cDNA含有831bp插入片段，編碼277個氨基酸殘基。推測的氨基酸序列具有典型的膠原凝集素結(jié)構(gòu)：N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸部和糖識別區(qū)。CL-L1與其他膠原凝集素相比，具有獨特之處，MBL、SP-A和SP-D基因定位于第10號染色體，而CL-L1基因定位于第8號染色體，C末端具有4個重復的賴氨酸結(jié)構(gòu)

9、，CRD和頸區(qū)由一個外顯子編碼，膠原樣區(qū)有5個外顯子編碼。膠原凝集素絕大多數(shù)為分泌型，存在于體液和分泌液中，只有CL-L1為可溶性胞漿內(nèi)蛋白，因此推測CL-L1可能具有獨特的功能。Human CL-L1的研究1999年Ohtani k.等克膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件調(diào)節(jié)前炎癥因子的合成分泌等克隆和鑒定出一個編碼新的膠原凝集素基因，稱肝臟膠原凝集素1（collectin liver 1， CL-L1），該基因定位于第八號染色體的長臂上，其基因結(jié)構(gòu)由6個外顯子（EX1EX6）和5個內(nèi)含子（IN1IN5）組成，cDNA含有831bp插入片段，

10、編碼277個氨基酸殘基。半乳糖結(jié)合基序: Gln-Pro-Asp(2)Inoculate 200 ml of prewarmed SOB media with 10 ml of the overnight cultures and grow at 37 C with vigorous shaking until an OD600 of 0.buffer 18M ureaTBS(pH7.induction 3 hrs(2)Apply lysate to column.1989-1991 mannan-binding lectin2001 collectin placenta 1(CL-P1)亞單

11、位進一步聚集成寡聚體2GXY+NECK+CRDkkkkDialysis of recombinant protein(四)抑制微生物的生長膠原凝集素絕大多數(shù)為分泌型，存在于體液和分泌液中，只有CL-L1為可溶性胞漿內(nèi)蛋白，因此推測CL-L1可能具有獨特的功能。induction 5 hrs六聚體SP-A, MBL (一束郁金香花)induction 5 hrs二、膠原樣凝集素歷史上的重要發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)前炎癥因子的合成分泌膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件膠原樣凝集素幻燈免疫最全課件Compari

12、son of three constructsConstructsMax.O.D.SolubilityIPTG inductionLeakage2GXY+NECK+CRD0.8no(PBS)yesyesNECK+CRD kkkk1part(TBS),no(PBS)noyes2GXY+NECK+CRDkkkk1nonoyesComparison of three constructsNeck+CRDkkkk M 1 2 3 425kDa17kDaM marker1 before induction induction 1 hr induction 3 hrs induction 5 hrsNec

13、k+CRDkkkk M 1 2 3 4Growth of standard E. coli expression culture(200 ml)(1)Inoculate 20 ml of SOB (containing ampicillin 100g/ml, chloramphenicol 35g/ml) in 100 ml flask. Grow the cultures overnight at 37 C.(2)Inoculate 200 ml of prewarmed SOB media with 10 ml of the overnight cultures and grow at 3

14、7 C with vigorous shaking until an OD600 of 0.6 is reached.(3)Take a 1 ml sample immediately before induction.(4)Induce expression by adding IPTG to a final concentration 1 mM.(5)Incubate the cultures for 3 hrs. Collect a second 1 ml sample.(6)Harvest the cells by centrifugation at 3500rpm for 25 mi

15、n.(7)Freeze the cells at -70.Growth of standard E. coli expPreparation of cleared E. coli lysate under denaturing conditions(1)Thaw the cell pellet for 15 min on ice and resuspend in lysis buffer at 5 ml per gram wet weight.(2)Stir cells for 15-60 min at room temperature.(3)Centrifuge lysate at 1000

16、0g for 20-30 min at room temperature to pellet the cellular debris. Save supernatant, and filter the supernatant with 0.45 m filter.(4)Add 10 l 2SDSsample buffer to 10 l supernatant and store at -20 C for SDSanalysis.Preparation of cleared E. coliPurification of Neck+CRD KKKK of hCL-L1 with Ni-NTA c

17、olumn(1)Equilibrate column with 5 column volumes of lysis buffer .(2)Apply lysate to column. Collect the pass-through for SDSanalysis(recycle once).(3)Wash with 10 column volumes of wash buffer until A280 is below 0.01. (4)Elute protein with elution buffer. Collect the single protein peak completely

18、.Purification of Neck+CRD KKKKDialysis of recombinant proteinbuffer 18M ureaTBS(pH7.6)/300ml; buffer 2 TBS(pH7.6)/3000ml(1)Add elution into membrane tube (MWCO15000), put the membrane in 300 ml buffer 1, stirring slowly.(2)Add 100 ml buffer 2 at 6 hour intervals, total 8 times.(3)At last put membrane in 2000 ml buffer 2 for dialysis