動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫新技術(shù)課件

1、動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫新技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代信息技術(shù)的飛速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，給動(dòng)物檢疫帶來了深刻的影響，為動(dòng)物疫病的診斷、檢測、監(jiān)測、處理等提供了更為快速、準(zhǔn)確和高效的技術(shù)與方法。本次講座簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)和信息技術(shù)基本類別與原理的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)分析現(xiàn)代生物技術(shù)和信息技術(shù)在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域中的應(yīng)用，并初步探討現(xiàn)代技術(shù)檢疫應(yīng)用的未來發(fā)展。 現(xiàn)代生物技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)代生物技術(shù)以現(xiàn)代生物學(xué)作為理論基礎(chǔ)，由生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、信息學(xué)等多種學(xué)科理論和技術(shù)相互交叉融合而成，其發(fā)展與材料、信息、傳感器、圖像處理、微機(jī)電系統(tǒng)等多種技術(shù)的發(fā)展息息相關(guān)，因而現(xiàn)代生物技術(shù)已經(jīng)突破傳統(tǒng)生物學(xué)的范疇，成為研究現(xiàn)代生物學(xué)的必

2、備工具和重要手段?；蚬こ碳?xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程 免疫血清學(xué)技術(shù)基礎(chǔ) 分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ) 抗原抗體反應(yīng) Reaction of Antigen and Antibody抗原抗體反應(yīng)的基本原理？構(gòu)象決定簇和線性決定簇2、比例性 抗原一般都是多價(jià)的，而抗體（IgG）則是二價(jià)的，只有二者比例適合時(shí)，抗原抗體才能結(jié)合得最充分，形成的抗原抗體復(fù)合物最多，反應(yīng)最明顯，結(jié)果出現(xiàn)最快，此稱為等價(jià)帶（zone of equivalence）。如抗原或抗體過多，則二者結(jié)合后均不能形成大的復(fù)合物，不呈現(xiàn)可見反應(yīng)，稱此為帶現(xiàn)象（zone phenomenon），出現(xiàn)在抗體過量時(shí)，稱為前帶（prezone），

3、出現(xiàn)在抗原過剩時(shí)，稱為后帶（postzone）。 比例性示意圖抗體過量比例合適抗原的量抗原過量抗體沉淀的量前帶等價(jià)帶后帶4、分階段反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段：第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第二為可見反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。此階段反應(yīng)慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。 5、敏感性 抗原抗體不僅有高度特異性，還具有較高敏感性，不僅可用于定性，還可用于檢測極微量的抗原抗體，其靈敏程度大大超過當(dāng)前應(yīng)用的常規(guī)化學(xué)方法

4、。但反應(yīng)的類型不同，其敏感性有很大的差異。反應(yīng)的組成成分 1）抗原 2）特異抗體 3）環(huán)境因素 基本因素：0.85%NaCl作電解質(zhì) 反應(yīng)溫度: 37或56 pH : 7.0 特殊因素:補(bǔ)體三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素四 、主要的抗原抗體反應(yīng)1、凝集反應(yīng)（Agglutination)2、沉淀反應(yīng)(Precipitation)3、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complement fixation test ,CFT)4、中和試驗(yàn)(Neutralization test)5 、免疫標(biāo)記 表 抗原抗體反應(yīng)的基本類 型 表反應(yīng)類型 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 檢測方法 敏感度沉淀反應(yīng) 液相沉淀試驗(yàn) 觀察沉淀、檢測濁度 +，+ 瓊脂凝膠

5、擴(kuò)散 觀察掃描沉淀線或環(huán) + 凝膠電泳技術(shù) 或峰或弧 +補(bǔ)體參與反應(yīng) 補(bǔ)體溶血試驗(yàn) 以裸眼或光電比色儀 + 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 觀察測定溶血現(xiàn)象 +免疫標(biāo)記技術(shù) 熒光免疫技術(shù) 檢測熒光現(xiàn)象 + 放射免疫技術(shù) 檢測放射性 + 酶標(biāo)免疫技術(shù) 檢測酶底物顯色 + 發(fā)光免疫技術(shù) 測定發(fā)光強(qiáng)度 + 生物素-親合素技術(shù) 結(jié)合其它標(biāo)記技術(shù) + 金標(biāo)免疫技術(shù) 檢測金顆粒沉淀 +凝集反應(yīng) 直接凝集試驗(yàn) 用裸眼、放大鏡或顯 + 間接凝集試驗(yàn) 微鏡觀察紅細(xì)胞或膠 + 凝集抑制試驗(yàn) 乳等顆粒和各種凝集 + 協(xié)同凝集試驗(yàn) 現(xiàn)象 + 抗球蛋白試驗(yàn) +中和反應(yīng) 病毒中和試驗(yàn) 病毒感染性喪失 + 毒素中和試驗(yàn) 外毒素毒性丟失 +

6、凝集反應(yīng)（Agglutination) 顆粒性抗原（完整的細(xì)菌細(xì)胞或紅細(xì)胞等）與其相應(yīng)的抗體在適合條件下反應(yīng)并出現(xiàn)凝集團(tuán)塊的現(xiàn)象。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱凝集素（agglutinin)。(一)直接凝集試驗(yàn)玻板凝集反應(yīng)試管凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)示意圖正相間接凝集試驗(yàn)(positive indirect agglutination test)用抗原致敏載體檢測標(biāo)本中相應(yīng)抗體的方法反相間接凝集試驗(yàn)(Reverse indrect agglutination)用特異性抗體致敏載體,檢測標(biāo)本中相應(yīng)抗原的反應(yīng),可用于檢測乙型肝炎病毒表面抗原甲胎蛋白新型

7、隱球菌莢膜抗原等.間接凝集抑制試驗(yàn)(Indirect agglutination inhibition test)是以抗原致敏的載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑,用于檢測標(biāo)本中是否存在與致敏載體相同的抗原的試驗(yàn).若用已知抗體致敏的載體及相應(yīng)的可溶性抗原作為診斷試劑,以檢測標(biāo)本中的抗體,此時(shí)稱為反相間接凝集抑制試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)(indirect hemagglutination test)將可溶性抗原(或抗體)吸附于人的O型紅細(xì)胞或綿羊家兔的紅細(xì)胞制成抗原致敏的紅細(xì)胞,與相應(yīng)抗體(或抗原)作用,在有電解質(zhì)存在的條件下,經(jīng)過一定時(shí)間可出現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象.膠乳凝集試驗(yàn)(latex aggluti

8、nation)抗原(或抗體)與膠乳結(jié)合(致敏)后,直接與待測標(biāo)本中抗體(或抗原)發(fā)生凝集反應(yīng),稱為膠乳凝集試驗(yàn).在豬萎縮性鼻炎的檢測中應(yīng)用較多。該試驗(yàn)的敏感性不及血凝試驗(yàn).沉淀反應(yīng)(Precipitation) 可溶性抗原（蛋白質(zhì)、多糖或類脂）與其相應(yīng)的抗體在合適條件下反應(yīng)并出現(xiàn)絮狀沉淀物的現(xiàn)象。用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱沉淀原(precipitinogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱沉淀素（precipitin) 。 環(huán)狀沉淀反應(yīng)(Ring precipitation test)原理:將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上面,因抗血清蛋白濃度高,比重大,在兩液交界的清晰界面上形成白色沉淀環(huán)為陽性反

9、應(yīng).技術(shù)要點(diǎn)方法評價(jià):簡便快速,但只能定性,敏感性低.Ascoli 反應(yīng) (1) 單擴(kuò)散 * 過程： 制含抗體凝膠板打孔加系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原及待測抗原保濕、37OC、一天結(jié)果觀察、計(jì)算（繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算待測抗原濃度,沉淀圈的面積與抗原含量成正比）。 *用途： 定性分析、定量分析。凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)(gel phase precipitation)含抗體凝膠AgAgAgAg沉 淀 環(huán) （2）瓊脂雙擴(kuò)散雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)又稱瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)抗原抗體復(fù)合物沉淀線是半滲透性屏障。特異性的抗原抗體不會(huì)擴(kuò)散通過沉淀線，但可允許其它抗原或抗體分子自由通過。因此，當(dāng)抗原抗體存在多種系統(tǒng)時(shí)，即將出現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反

10、應(yīng)。從沉淀線的形狀、位置及寬度，還可進(jìn)一步了解兩個(gè)反應(yīng)物的相對濃度及擴(kuò)散速度，而擴(kuò)散速度與分子量呈反比，因此，也可間接了解反應(yīng)物分子量的大小。雙向雙擴(kuò)散沉 淀 帶AbAgAbAg (3) 免疫電泳測定法 （immunoelectrophoresis） * 免疫電泳與擴(kuò)散的結(jié)合 * 過程：先電泳（制板凝固前加玻棒打孔加抗原、指示劑電泳）再雙擴(kuò)散（取出玻棒制槽加抗體放入濕盒、37OC、擴(kuò)散1天）結(jié)果觀察。 * 用途：定性、純度檢察、不同組分分析。免疫電泳過程 * 過程：制板打孔加抗原、抗體電泳. * 用途：定性分析，普查。 * 優(yōu)點(diǎn)：較雙擴(kuò)時(shí)間短（3090min）、檢查樣品多. 對流免疫電泳（co

11、unter immunoelectrophoresis）原理 當(dāng)抗原和抗體在瓊脂介質(zhì)中電泳時(shí)，由于抗體的pH比較高，在適當(dāng)?shù)膒H值下抗體帶正電而抗原帶負(fù)電，故在電場中抗體向陰極方向移動(dòng)而抗原向陽極方向移動(dòng)，直至相遇出現(xiàn)沉淀線。其原理與雙向免疫擴(kuò)散相同，但具有方法簡便、快速及一次電泳可以檢測多個(gè)品等特點(diǎn)。對流免疫電泳結(jié)果判定 第一次觀察：從電泳槽取出瓊脂板，對光觀察抗原孔與抗體孔間是否有白色沉淀線，有沉淀線者為陽性，無沉淀線者為陰性。第二次觀察：”瓊脂板置濕盒中37保溫?cái)?shù)小時(shí)后觀察。 如標(biāo)本需保存可染色與保存。 注意事項(xiàng) (1)本試驗(yàn)靈敏度高，有出現(xiàn)假陽性的可能，每次電泳均應(yīng)設(shè)陽性對照、陰性對照

12、，對電泳結(jié)果沉淀線模糊不清的樣品應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 (2)本試驗(yàn)中抗原和抗體的濃度應(yīng)接近，如抗原濃度過高，可造成假陰性的結(jié)果，需將抗原稀釋予以解決。應(yīng)用(1)該試驗(yàn)適用于傳染病和寄生蟲病的快速診斷，如HBsAg的檢測，血吸蟲、包蟲病等的抗體測定。樣品多時(shí)可用大玻板。(2)本試驗(yàn)還可用于抗血清效價(jià)的測定，將抗血清作一系列倍比稀釋，與抗原孔間出現(xiàn)清晰沉淀線的抗血清的最大稀釋度為該血清的效價(jià)?；鸺庖唠娪緲?biāo) 準(zhǔn) 抗 原待 測 抗 原含 抗 體 凝 膠+ 有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅細(xì)胞和溶血素（紅細(xì)胞的特異抗體）作指標(biāo)系統(tǒng)的靈敏度很高的抗原抗體反應(yīng)。 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)Complement fixation test

13、 ,CFT試驗(yàn)系統(tǒng): 抗原 抗體 補(bǔ)體指示系統(tǒng): 紅細(xì)胞 溶血素 中和反應(yīng)(Neutralization test)抗體使相應(yīng)抗原（毒素或病毒）的毒性或傳染性喪失的反應(yīng)稱為中和反應(yīng)。 毒素或病毒種型的鑒定與抗原性分析抗毒素或中和抗體的效價(jià)滴定基本過程：抗血清與病毒混合經(jīng)適當(dāng)時(shí)間作用，然后接種于宿主系統(tǒng)以檢測混合液中的病毒感染力。 例1 -NDV(新城疫病毒） 911d雞胚 2448h雞胚死亡 -NDV+抗血清 911d雞胚 雞胚不死亡例2 口蹄疫病毒(FMDV) 47d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 47d乳鼠 乳鼠不死亡例3 FMDV 仔豬腎傳代細(xì)胞(IB-RS-2)單層細(xì)胞 細(xì)胞病變(C

14、PU)：變圓、成串、空泡、變形、脫落、裂解FMDV+抗血清 IB-RS-2單層細(xì)胞 細(xì)胞無病變CPU用途：1.用已知血清檢測病毒 鑒定病毒，診斷病毒病2.用已知病毒檢測血清抗體 診斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價(jià)（中和價(jià)）免疫標(biāo)記技術(shù) 用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；借助熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標(biāo)檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測定；可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；免疫標(biāo)記技術(shù)在應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半

15、抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測定。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般免疫血清學(xué)方法。免疫標(biāo)記技術(shù)的分類根據(jù)試驗(yàn)中所用標(biāo)記物的種類和檢測方法不同，免疫標(biāo)記技術(shù)分為：免疫熒光技術(shù)放射免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測定免疫標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用范圍近年來，隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)、免疫化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的進(jìn)展以及應(yīng)用現(xiàn)代高新技術(shù)建立的儀器分析日趨發(fā)展，免疫標(biāo)記技術(shù)也不斷完善和更新。各種新技術(shù)和新方法不斷涌現(xiàn)，至今已發(fā)展成為一類檢測微量和超微量生物活性物質(zhì)的免疫生物化學(xué)分析技術(shù)。在醫(yī)學(xué)和其他生物學(xué)科的研究領(lǐng)域及臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用十分廣泛。 免疫熒光

16、技術(shù)（Immunofluorescence technique)原理免疫熒光分析技術(shù)是一種以熒光物作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，可以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長較照射光長的熒光。 熒光素 熒光素是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后即可引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時(shí)停止?？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)，稱熒光素。常用的有：異硫氰酸熒光素(FITC) 四乙基羅丹明(RB200) 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC) 熒光抗體染色方法 直接法 用特異熒光抗體直接滴加于待檢抗原標(biāo)本上，由于標(biāo)記抗原與抗體發(fā)生特

17、異性結(jié)合，使之呈現(xiàn)熒光，根據(jù)熒光分布和形態(tài)確定抗原性和部位。 間接法 可用于檢測抗原和抗體。用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與標(biāo)本中之相應(yīng)抗體(第l抗體)結(jié)合，再用針對第l抗體的抗抗體即第2抗體(熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在。 補(bǔ)體法 在抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體(多用脈鼠補(bǔ)體)，再用熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體(如抗C3)進(jìn)行示蹤。 熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn) “-”無或可見微弱熒光“+”僅能見明確可見的熒光“+”可見有明亮的熒光“+”可見耀眼的熒光。免疫酶技術(shù)一種把抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的專一性有機(jī)結(jié)合起來的血清學(xué)方法。酶免疫測定的優(yōu)點(diǎn)1）反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生顏色，可用顯微鏡觀

18、察結(jié)果。2）標(biāo)本經(jīng)酶標(biāo)抗體染色后，還可用其他染料復(fù)染，顯示細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。3）標(biāo)本可長久保存，隨時(shí)備查。4）特異性強(qiáng)。5）靈敏度高。標(biāo)記酶應(yīng)具備的條件純度高、高溶性、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高。測定方法應(yīng)簡單、敏感、快速。與底物作用后會(huì)呈現(xiàn)顏色。與抗體交聯(lián)后，仍保持酶活性。最常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（horeradish peroxidase,HRP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）ELISA的關(guān)鍵是利用抗原抗體的特異性吸附，在固相載體上像搭積木似地一層一層疊加（兩層、三層或更多層）。最上面一層必須是酶標(biāo)記物。整個(gè)反應(yīng)必須在抗原抗體的最適條件下進(jìn)行。ELISA的測定方法有直接法，間接法（用于測抗體），

19、雙抗體夾心法（用于測抗原），競爭法（用于測小分子抗原及半抗原）等。直接法用于檢測抗原或抗體，特別是總抗體濃度。1.不同濃度的抗原（或抗體）包被反應(yīng)板2.封閉，洗滌。3.加酶標(biāo)抗體（或抗原），洗滌。4.加入底物，測定。直接法間接法用于測定抗體1.抗原包被，孵育后洗滌2.封閉，孵育后洗滌3.加入待測樣品，孵育后洗滌4.加入酶標(biāo)二抗，孵育后洗滌5.加入酶底物，測定間接法包被洗滌加一抗即待檢血清間接ELISA法檢測抗體的方法步驟加酶標(biāo)二抗洗滌洗滌加底物溶液顯色加終止液結(jié)果判定雙抗體夾心法用于測定大分子抗原純化特異性抗體或特異性抗血清包被反應(yīng)板，孵育后洗滌封閉，孵育后洗滌加入待測樣品，孵育后洗滌加入酶標(biāo)

20、特異性抗體，孵育后洗滌加入底物，測定雙夾心法應(yīng)用同雙抗體夾心法，優(yōu)點(diǎn)是不標(biāo)記特異性抗體，缺點(diǎn)是復(fù)雜。1.純化特異性抗體或特異性抗血清包被反應(yīng)板，孵育后洗滌2.封閉，孵育后洗滌3.加入待測樣品，孵育后洗滌4.加入第二種動(dòng)物的特異性抗體，孵育后洗滌5.加入抗第二種動(dòng)物特異性抗體的酶標(biāo)抗體，孵育后洗滌6.加入酶底物，測定競爭法主要用于測定小分子抗原 1.純化特異性抗體或特異性抗血清包被反應(yīng)板，孵育后洗滌 2.封閉，孵育后洗滌 3.加入待測樣品,再加入一定量的酶標(biāo)記抗原(對照孔只加酶標(biāo)記抗原),孵育后洗滌 4.加入底物，測定，顏色與抗原量成反比。斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（DotELIS

21、A）是近年來建立的一項(xiàng)免疫酶新技術(shù)。以纖維素膜代替ELISA試驗(yàn)中常用的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。放射免疫標(biāo)記技術(shù) 將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測定方法。放射免疫標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)RIA技術(shù)具有靈敏度高，可檢測出ng(10-9g)至pg (10-12g) ，甚至fg (10-15g)的超微量物質(zhì)。特異性強(qiáng)(可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原)、重復(fù)性強(qiáng)、樣品及試劑用量少、測定方法易規(guī)范化和自動(dòng)化等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因此、在醫(yī)學(xué)及其他生物學(xué)科的研究領(lǐng)域和臨床實(shí)驗(yàn)診斷中廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標(biāo)志物等的分析與定量測定。 其它免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫電鏡技

22、術(shù)(Immune electron microscopy，IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。 膠體金染色凝集素標(biāo)記物 凝集素是一類從各種植物種子和動(dòng)物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦稱外源凝集素。常用的為植物凝集素有刀豆素A、麥胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等。凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金

23、等結(jié)合、而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作。免疫印跡技術(shù) 免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)或非變性電泳(NativePAGE)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。Western blot method生物素與親合素標(biāo)記技術(shù) 生物素親合素系統(tǒng) (bi

24、otin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。BAS的應(yīng)用生物素親合素系統(tǒng)（BAS）已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的各個(gè)領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。 生物素(biotin) 生物素廣泛分布于動(dòng)、植物組織中，常從含量較高的卵黃(型)和肝組織(型)，提取兩型的生物活性基本相同，現(xiàn)已可人工

25、合成。生物素在機(jī)體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶R或維生素H。親合素 (avidin) 親合素亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白親合素與生物素間的親和力親合素與生物素之間的親和力極強(qiáng)，二者結(jié)合的親和常數(shù)(Ka)為1015mol-1，比抗原與抗體的親和力(Ka：105-11mol-1)至少高1萬倍，因此二者能快速結(jié)合，而且反應(yīng)不受外界干擾，具有高度特異性和穩(wěn)定性。親合素富含色氨酸(約占6)，與其生物活性密切相關(guān)，因?yàn)橛H合素是借助色氨酸殘基與生物素的咪唑酮環(huán)結(jié)合。以結(jié)合1g生物素所需的親合素量作為其活性單位，lmg純的親合素約含1315個(gè)活性單位。 發(fā)光免疫

26、測定法(Luminescent immunoassay) 將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫測定法結(jié)合起來的新型技術(shù)。 常用的發(fā)光試劑有魯米諾（luminol)和光澤精(lucigenin)。發(fā)光免疫測定法優(yōu)點(diǎn)1、可定量檢測抗原或抗體。2、靈敏度高，約比酶免疫技術(shù)高1000倍。3、試劑穩(wěn)定、無毒。4、檢測操作簡便、快速（半小時(shí)至數(shù)小時(shí)）。免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用免疫檢測技術(shù)以廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。1、免疫疾病診斷2、動(dòng)物植物生理活動(dòng)研究3、物種及微生物鑒定4、動(dòng)物、植物性狀的免疫標(biāo)記 5、免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究 6、發(fā)病機(jī)理研究 7、分子生物學(xué)研究 分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使動(dòng)物疫病的

27、診斷和檢疫邁上了一個(gè)新的臺(tái)階。常規(guī)的病原分離鑒定技術(shù)和抗原抗體的免疫學(xué)檢測技術(shù)在動(dòng)物疫病的診斷和檢疫中發(fā)揮了極其重要的作用，愈來愈多的疫病建立了更加敏感特異的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，動(dòng)物疫病的診斷和檢疫進(jìn)入了對病原基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接測定的分子生物學(xué)水平。目前分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸雜交、寡核苷酸指紋圖譜、限制性片段長度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA、脈沖電場凝膠電泳、DNA序列測定、DNA芯片、DNA生物傳感器等。其中PCR和核酸雜交技術(shù)具有特異、敏感、快速、適于疫病早期診斷和大量樣品的檢測而成為分子生物學(xué)診斷技術(shù)中最常用和最具應(yīng)用價(jià)值的方法。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在體

28、外利用耐熱DNA聚合酶將少量DNA片段短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種方法。PCR方法具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、對檢測材料要求低等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。目前在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上根據(jù)應(yīng)用目的不同又衍生出一系列改良PCR方法，包括反轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、兼并引物PCR、免疫PCR等。PrimerIPrimerIIAmplified target fragment基本原理和步驟包括：將模板DNA置高溫下變性為單鏈，然后在較低溫度下將人工合成的寡核苷酸引物與目的片段互補(bǔ)結(jié)合，DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物3端引人，沿模板53方向延伸，合成新的 DNA雙鏈

29、作為下次循環(huán)的模板，如此以指數(shù)方式增加，經(jīng)約30個(gè)循環(huán)使最初的模版DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍。寡核苷酸指紋圖 該技術(shù)主要用于RNA病毒分析。原理:將提純的病毒RNA，通過T1核糖核酸酶酶切，產(chǎn)生大小不同的片段，經(jīng)放射性同位素標(biāo)記后，進(jìn)行垂直雙相電泳，再經(jīng)放射自顯影獲得特征性的圖譜。該技術(shù)可很好地區(qū)別同一血清型或亞型的不同分離株，并可對病毒核苷酸序列進(jìn)行半定量比較，因而對容易出現(xiàn)變異的病毒鑒定很有價(jià)值，尤其是在鑒定新出現(xiàn)或重新出現(xiàn)的病毒株上有很重要的應(yīng)用價(jià)值。限制性片段長度多態(tài)性 是將限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術(shù)和雜交技術(shù)相結(jié)合而建立的一種檢測技術(shù)。原理：首先利用限制性內(nèi)切酶消化DNA，通過凝膠電泳

30、形成酶切圖譜，然后轉(zhuǎn)印至膜上，利用制備的探針進(jìn)行雜交，從而鑒定出不同生物間的關(guān)系。該方法具有穩(wěn)定性好、敏感性高，可進(jìn)行同種內(nèi)不同個(gè)體的鑒別。核酸雜交 基本原理：堿基互補(bǔ)的兩條單鏈核酸經(jīng)退火后形成雙鏈。用于診斷目的的雜交雙方是已知序列的標(biāo)記探針和待檢測樣品中的核酸。標(biāo)記的核酸探針必須具有高度特異性，通常用檢測病原的特異序列核酸片段進(jìn)行標(biāo)記。核酸探針的種類包括基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。標(biāo)記物主要有放射性標(biāo)記物(如32P)和非放射性標(biāo)記物(如地高辛)。核酸雜交具有敏感、特異，可同時(shí)檢測大量樣品的優(yōu)點(diǎn)，因而在疫病診斷和檢疫中也得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)核酸性質(zhì)和支持介質(zhì)的不同，主要有點(diǎn)雜交(Dot-blotting)、DNA印跡雜交 、RNA印跡雜交、原位雜交。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 該技術(shù)應(yīng)用一個(gè)隨機(jī)引物(通常10個(gè)堿基)對待檢測DNA進(jìn)行非特異性地?cái)U(kuò)增DNA片段，然后在凝膠電泳上觀察擴(kuò)增片段。該法操作簡單，不需設(shè)計(jì)特異引物，用一個(gè)引物即可擴(kuò)增出一系列片段，適于對未知DNA序列的基因組進(jìn)行分析。但本法重復(fù)性稍差 脈沖電場凝膠電泳 該技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種新的電泳技術(shù)