細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件

1、細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使細(xì)胞或組織在體外生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。 2細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，動(dòng)物細(xì)胞與組 細(xì)胞培養(yǎng)( Cell culture )：指的是在無(wú)菌條件下，把動(dòng)、植物細(xì)胞從組織中取出，在體外模擬機(jī)體的生理環(huán)境，使離體的細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。3細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)( Cell culture )：指的是在無(wú) 活細(xì)胞是構(gòu)成活的有機(jī)體的基本單位。

2、 生、老、病、死、優(yōu)生、抗衰老、防治各種疾病的途徑、人為地誘導(dǎo)和改變細(xì)胞的遺傳性狀和特性，等等均與活細(xì)胞的研究密切相關(guān)。4細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 活細(xì)胞是構(gòu)成活的有機(jī)體的基本單位。4細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)研究的發(fā)展簡(jiǎn)史5細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第一節(jié) 5細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1665年：Robert Hooke（英） 用自己制造的顯微鏡觀察軟木片，發(fā)現(xiàn)有許多小孔，狀如蜂窩，他便稱之為細(xì)胞（cell）。這是細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。1838年: M.J.Schleiden（德） 植物學(xué)家施萊登提出：細(xì)胞是一切植物的基本構(gòu)造；細(xì)胞不僅本身是獨(dú)立的生命，并且是植物體生命的一部分，并維系著整個(gè)植物體的生命。6細(xì)胞工程學(xué)

3、醫(yī)學(xué)知識(shí)1665年：Robert Hooke（英）6細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知1839年：T.A.H.Schwann（德） 動(dòng)物學(xué)家施旺受到施萊登的啟發(fā)，結(jié)合自身的動(dòng)物細(xì)胞研究成果，把細(xì)胞說(shuō)擴(kuò)大到動(dòng)物界，提出一切動(dòng)物組織均由細(xì)胞組成，從而建立了生物學(xué)中統(tǒng)一的細(xì)胞學(xué)說(shuō)。 7細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1839年：T.A.H.Schwann（德）7細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)1859年：Vupian(法) 蛙尾部組織切下放入普通水中進(jìn)行“培養(yǎng)”，觀察到生長(zhǎng)和分化現(xiàn)象。1885年：Roux(德) 把雞胚的神經(jīng)板在溫?zé)岬纳睇}水中維持其存活數(shù)天，這是有記錄的第一個(gè)體外移植成功的例子，也是首次體外培養(yǎng)的嘗試 。8細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)185

4、9年：Vupian(法) 8細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 1897年：B .Loeb 首次在含有少量血漿凝塊的試管中培養(yǎng)成年兔的肝、腎、甲狀腺和卵巢植塊，植塊在3天內(nèi)仍能保持正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。這是器官培養(yǎng)的最早嘗試。9細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 1897年：B .Loeb9細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1906年：SP Beele J Ewing 蓋片懸滴法用動(dòng)物血清使狗的淋巴肉瘤細(xì)胞在體外存活了72小時(shí)。 體外培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)端。問(wèn)題：血漿與血清的區(qū)別？10細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1906年：SP Beele J Ewing10細(xì)胞工程學(xué) 血漿是離開(kāi)血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過(guò)離心沉淀，所獲得的不含細(xì)胞成分的液體，其中含有纖維蛋白

5、原（纖維蛋白原能轉(zhuǎn)換成纖維蛋白，具有凝血作用），若向血漿中加入Ca2+ ，血漿會(huì)發(fā)生再凝固，因此血漿中不含游離的Ca2+。血漿和血清的區(qū)別 11細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 血漿是離開(kāi)血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過(guò)離心沉淀， 血清是離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體，其中已無(wú)纖維蛋白原，但含有游離的 Ca2+，若向其中再加入 Ca2+，血清也不會(huì)再凝固。 血清中少了很多的凝血因子，但多了很多的凝血產(chǎn)物。另外，血清中含有特異性免疫體(如抗毒素或凝集素)的免疫血清(抗菌素血清)。 12細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 血清是離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體1907年：R Harrison A Carrel

6、 將蛙胚髓管部的小片接種于蛙的淋巴液中，并用蓋片懸滴法培養(yǎng)細(xì)胞，有神經(jīng)突起從培養(yǎng)的神經(jīng)組織塊長(zhǎng)出。第一次較為系統(tǒng)的觀察了體外培養(yǎng)活體組織的結(jié)果。 真正創(chuàng)立體外培養(yǎng)技術(shù)。13細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1907年：R Harrison A Carrel13細(xì)胞1907年的實(shí)驗(yàn)標(biāo)志著： 體外培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)立； 蓋玻片懸滴法的建立； 神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的開(kāi)始； 神經(jīng)突起是由神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出的重大理論誕生。14細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1907年的實(shí)驗(yàn)標(biāo)志著：14細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)法國(guó)科學(xué)家A.Carrel的實(shí)驗(yàn)貢獻(xiàn): 第一次將無(wú)菌操作概念引入體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中。 創(chuàng)立培養(yǎng)組織包埋技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及傳代培養(yǎng)等許多條件和方法并引入蓋玻

7、片懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)。15細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)法國(guó)科學(xué)家A.Carrel的實(shí)驗(yàn)貢獻(xiàn):15細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)作為他技術(shù)才華的標(biāo)志： 他在完全沒(méi)有抗生素的條件下，從一個(gè)雞胚心臟組織開(kāi)始，將不斷進(jìn)行細(xì)胞傳代，竟使雞胚心臟的細(xì)胞維持生存了34年，先后傳代3400次，令人信服地證明動(dòng)物細(xì)胞有可能在體外無(wú)限地生長(zhǎng)。16細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)作為他技術(shù)才華的標(biāo)志：16細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 1911年：M R Lewis 和W H Lewis兄弟對(duì)體外細(xì)胞生存所必需的條件進(jìn)行了研究初步探索，研究了NaCl、CaCl、KCl、NaHCO3等生理鹽溶液成分與培養(yǎng)物生長(zhǎng)的關(guān)系。17細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 1911年：M R Lewi

8、s 和W H Lewis兄弟對(duì)1913年：Steinhand 體外培養(yǎng)痘苗病毒，為病毒學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 1915年：Goldschmidt 無(wú)脊椎動(dòng)物組織的體外培養(yǎng)，成功的培養(yǎng)了鱗翅目昆蟲(chóng)組織。18細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1913年：Steinhand 18細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1925年：Maximow 雙蓋片懸滴培養(yǎng)法。1926年： Carrely 卡氏瓶培養(yǎng)法，開(kāi)創(chuàng)玻璃瓶培養(yǎng)方法。1926年：Strangeways 試管培養(yǎng)法。19細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)19細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1933年：Gel 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法，并以此建立了許多細(xì)胞系，如：Hela細(xì)胞系。1949年：Polge等 發(fā)現(xiàn)甘油保護(hù)儲(chǔ)存細(xì)胞功能

9、，解決冷凍細(xì)胞受損的問(wèn)題。 20細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1933年：Gel 20細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1950年：Morgan等人提出的199人工培養(yǎng)基 配方。1951年：Shannon和Earle建立T瓶培養(yǎng)法。1951年：Poment改良和設(shè)計(jì)了結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 且易于消毒的灌流小室，使得 體外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠在不斷更 新的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。1954年：Earle建立了懸浮培養(yǎng)法。21細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1950年：Morgan等人提出的199人工培養(yǎng)基 21細(xì)胞1957年：Dullbecco等人開(kāi)始采用胰蛋 白酶消化處理來(lái)分離細(xì)胞的方法以及應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，使得體外培養(yǎng)單層細(xì)胞成為可能。1959年：Lovel

10、ock發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)冷凍保護(hù)劑二甲亞砜，凍存細(xì)胞效果更好。22細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1957年：Dullbecco等人開(kāi)始采用胰蛋 白酶消化1967年：AL Van Wezel 創(chuàng)立了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，增加了細(xì)胞附著的表面,充分利用空間和營(yíng)養(yǎng)液，大大提高細(xì)胞和產(chǎn)物的數(shù)量及質(zhì)量,大大減少勞力和成本。1972年：RA Knazek等創(chuàng)立了中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高了空間利用效率，將二維空間擴(kuò)展為三維空間，與體內(nèi)毛細(xì)管效應(yīng)更為接近。23細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1967年：AL Van Wezel 創(chuàng)立了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)室和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備24細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第二節(jié) 24細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)

11、胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物污染和不受其它有害因素的影響。 25細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)總體要求環(huán)境：清爽整齊、井然有序、明潔清靜、簡(jiǎn)單高效。要求：無(wú)塵、無(wú)毒、無(wú)菌。布局：內(nèi)外有別。門、窗、墻的合理布局。 26細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)總體要求環(huán)境：26細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)準(zhǔn)備室：培養(yǎng)器皿的清洗、烘干、包裝、培養(yǎng)物品的消毒、培養(yǎng)用液的配制以及供應(yīng)物品的儲(chǔ)藏。緩沖室：換取消毒服、帽、罩、鞋等。培養(yǎng)室：專用進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無(wú)菌操作的實(shí)驗(yàn)室。 27細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)準(zhǔn)備室：培養(yǎng)器皿的清洗、烘干、包裝、培

12、養(yǎng)物品的消毒、培養(yǎng)用液培 養(yǎng) 室門：用拉門減少揚(yáng)塵，迷宮式分布。窗：最好無(wú)窗，避免直射，減少溫差變化。墻：光滑、不反光、不刺激。地：用瓷磚或水磨石鋪，既光潔又防滑。燈：熒光燈、紫外燈、煤氣燈或酒精燈。臺(tái)：超凈工作臺(tái)、操作臺(tái)。28細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)培 養(yǎng) 室28細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)29細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)29細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)二、細(xì)胞培養(yǎng)的儀器設(shè)備30細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)二、細(xì)胞培養(yǎng)的儀器設(shè)備30細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1、 超凈工作臺(tái)31細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1、 超凈工作臺(tái)31細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)32細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)32細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、培養(yǎng)設(shè)備（1）恒溫培養(yǎng)箱： 干熱式；隔水式。（2）CO2培養(yǎng)箱：

13、5%CO2，維持培養(yǎng)液pH穩(wěn)定 減緩培養(yǎng)液的酸化。33細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、培養(yǎng)設(shè)備（1）恒溫培養(yǎng)箱：33細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、消毒設(shè)備 （1）高壓蒸汽消毒鍋 （2）電熱干燥箱 （3）過(guò)濾除菌裝置 34細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、消毒設(shè)備 （1）高壓蒸汽消毒鍋 34細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)4、冰 箱（1）家用冰箱 （2）低溫冰箱 （3）冷藏柜 （4）冷凍柜 35細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)4、冰 箱（1）家用冰箱 35細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)5、水質(zhì)純化裝置（1）重蒸水裝置（2）去離子水制備（3）逆向滲透凈水裝置 36細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)5、水質(zhì)純化裝置（1）重蒸水裝置36細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)水質(zhì)處理與制備重蒸水蒸餾器去離子水生

14、產(chǎn)機(jī)37細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)水質(zhì)處理與制備重蒸水蒸餾器去離子水生產(chǎn)機(jī)37細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知6、顯 微 鏡（1）倒置相差顯微鏡 （2）熒光顯微鏡 （3）紫外光顯微鏡 （4）普通光學(xué)顯微鏡38細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)6、顯 微 鏡（1）倒置相差顯微鏡 38細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)相差顯微鏡39細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)相差顯微鏡39細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)熒光顯微鏡40細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)熒光顯微鏡40細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 用熒光染料對(duì)細(xì)胞中成分進(jìn)行特異染色，由染料發(fā)出的熒光稱為染色熒光。 經(jīng)化學(xué)反應(yīng)使組織中非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕镔|(zhì)所發(fā)的熒光稱為誘發(fā)熒光。 41細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 用熒光染料對(duì)細(xì)胞中成分進(jìn)行特異染色，由染料發(fā)7、離

15、 心 機(jī)（1）臺(tái)式離心機(jī) （2）冷凍高速離心機(jī) 42細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)7、離 心 機(jī)（1）臺(tái)式離心機(jī) 42細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)臺(tái)式離心機(jī)43細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)臺(tái)式離心機(jī)43細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)高速冷凍離心機(jī)44細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)高速冷凍離心機(jī)44細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)8、細(xì)胞冷凍貯存裝置 1液氮罐 2超低溫冰箱 45細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)8、細(xì)胞冷凍貯存裝置 1液氮罐 45細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)液氮罐超低溫冰箱46細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)液氮罐超低溫冰箱46細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)9.其它儀器設(shè)備 （1）清洗裝置： 浸泡器皿、沖洗水槽、超聲波玻璃器皿洗滌機(jī)等。 47細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)9.其它儀器設(shè)備 （1）清洗裝置：47

16、細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（2）酸 度 機(jī)： 甘汞電極酸度計(jì) 電子精密酸度計(jì) 48細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（2）酸 度 機(jī)：48細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)甘汞電極酸度儀49細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)甘汞電極酸度儀49細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）天 平 電子天平 電光天平 普通天平50細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）天 平50細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（4）消化設(shè)備恒溫水浴鍋 恒溫磁力攪拌器旋渦震蕩器51細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（4）消化設(shè)備恒溫水浴鍋 51細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)三、實(shí)驗(yàn)室器具器皿52細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)三、實(shí)驗(yàn)室器具器皿52細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1、金屬器具解剖剪刀止血鉗鑷子刀片解剖刀53細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1、金屬器具解剖剪刀止血鉗鑷子刀片解

17、剖刀53細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知2、玻璃器皿和塑料器皿 54細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、玻璃器皿和塑料器皿 54細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、輔助工具各式移液器55細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、輔助工具各式55細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第三節(jié)培養(yǎng)器具器皿的清洗、包裝、消毒56細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第三節(jié)56細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)一、清洗與包扎 清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面防止細(xì)菌污染，另一方面有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。玻璃表面性質(zhì)與細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)能力有關(guān)。 57細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)一、清洗與包扎 清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面防止1清洗玻璃器皿的流程浸泡 洗滌 沖洗 烘干 酸浸 沖洗 蒸餾水沖洗 瀝水 烘干 包扎58細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)1清

18、洗玻璃器皿的流程浸泡 洗滌 沖洗 洗 滌 劑1洗潔凈類2強(qiáng)氧化劑類強(qiáng)酸洗液的配制：弱液： 重鉻酸鉀 50g 蒸餾水 1000ml 濃硫酸 90ml 強(qiáng)液： 重鉻酸鉀 120g 蒸餾水 1000ml 濃硫酸 160ml(先加熱溶解重鉻酸鉀，冷后緩緩加入濃硫酸)59細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)洗 滌 劑1洗潔凈類59細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、清洗橡膠制品的流程 新制品：浸泡 堿煮（0.5mol/L NaOH 30min） 沖洗 酸煮（0.5mol/L HCl 30min） 沖洗 蒸餾水沖洗 烘干 包扎舊制品：水煮 沖洗 蒸餾水沖洗 烘干 包扎 60細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、清洗橡膠制品的流程 新制品：60細(xì)胞工程學(xué)

19、醫(yī)學(xué)知識(shí)3、清洗金屬制品的流程 75%酒精擦洗超凈臺(tái)處吹干包扎 61細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、清洗金屬制品的流程 75%酒精擦洗61細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)二、消毒滅菌 62細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)二、消毒滅菌 62細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)消毒方法分為三類：物理消毒法化學(xué)消毒法抗生素抑菌法63細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)消毒方法分為三類：63細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（一）物理消毒法 1、高壓蒸氣消毒玻璃器皿 15磅 121 30分橡膠制品 15磅 121 15分 塑料制品 5磅 108 15分64細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（一）物理消毒法 1、高壓蒸氣消毒64細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、干熱消毒 消毒耐高溫的材料器皿， 如玻璃、金屬等。 一般

20、160 60分鐘。 注意：冷卻后才能打開(kāi)烘箱門 ，防止玻璃爆裂或起火燃燒。65細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2、干熱消毒 消毒耐高溫的材料器皿，65細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)3、濾過(guò)消毒（1）負(fù)壓濾過(guò) （2）正壓濾過(guò) 66細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、濾過(guò)消毒（1）負(fù)壓濾過(guò) （2）正壓濾過(guò) 66細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)4、紫外線消毒 環(huán)境消毒5、輻射消毒 由60Co產(chǎn)生的射線，穿透力強(qiáng)，滅菌物品不升溫。6、煮沸消毒 適宜于臨時(shí)需要消毒的耐熱物品，如金屬器具和注射器等在水中煮沸2030分鐘即可用。 67細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)4、紫外線消毒67細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（二）化學(xué)消毒法 化學(xué)消毒劑，包括酒精、新潔爾滅、來(lái)蘇兒、過(guò)氧乙酸、環(huán)氧乙烷、碘酒、戊

21、二醛等。 68細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（二）化學(xué)消毒法68細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（三）抗生素消毒法 抗生素消毒作用主要是抑制液體內(nèi)的細(xì)菌繁殖，因此適用于細(xì)胞培養(yǎng)用液的消毒。實(shí)驗(yàn)室常用的是青、鏈霉素混合液也稱“雙抗”液，還有卡那霉素液等，其抑菌效果均很好。 69細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（三）抗生素消毒法69細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)培養(yǎng)用品清洗和消毒程序70細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)培養(yǎng)用品清洗和消毒程序70細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)必須注意什么？71細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)必須注意什么？71細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第四節(jié) 培養(yǎng)用液的制備 72細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)第四節(jié) 72細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)一、培養(yǎng)用液的組成 1水 作

22、用：（1）細(xì)胞賴以生存的主要條件；（2）維持細(xì)胞形態(tài)；（3）進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)；（4）溫度傳導(dǎo)；（5）調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿度的平衡。 73細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)一、培養(yǎng)用液的組成 73細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2平衡鹽溶液 用途：洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。作用：（1）維持滲透壓；（2）調(diào)控酸堿平衡；（3）供給細(xì)胞生存所需能量和無(wú)機(jī)離子成分。 74細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2平衡鹽溶液 74細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、天然培養(yǎng)基 血清、組織提取液（如雞血漿、雞胎汁等），血清是一種廣泛應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，市場(chǎng)有售，血漿應(yīng)用較少，用時(shí)多自己制備。 75細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3、天然培養(yǎng)基 血清、組織提取液（如雞血漿、

23、雞胎（1）雞血漿的制備？76細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（1）雞血漿的制備76細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（2）雞胚浸出液的制備 77細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（2）雞胚浸出液的制備 77細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)雞胚浸出液的制備過(guò)程78細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)雞胚浸出液的制備過(guò)程78細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）血 清 1） 種類： 人血清 胎牛血清 動(dòng)物血清 牛血清 小牛血清 馬血清 79細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）血 清 1） 種類：79細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2）成分 蛋白質(zhì)（血清的主要成分） 主要為白蛋白和球蛋白；如纖維粘連素能促進(jìn)細(xì)胞附著；2巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；轉(zhuǎn)鐵蛋白能結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞所利用。80細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)2

24、）成分 80細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 多肽 凝成血塊后析出的血清有增殖作用，要比去掉血細(xì)胞后分離出的血漿作用強(qiáng)。原因是在凝血過(guò)程中從血小板釋放出一種多肽血小板促生長(zhǎng)因子（PDGF）的結(jié)果。81細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 多肽 凝成血塊后析出的血清有增殖作用，要比 多肽血小板促生長(zhǎng)因子（PDGF）是促細(xì)胞分裂多肽家族成員之一，是血清中主要促細(xì)胞增殖因子。PDGF有促成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，但對(duì)上皮細(xì)胞增殖的作用可能為促細(xì)胞分化。82細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 多肽血小板促生長(zhǎng)因子（PDGF）是促細(xì)胞分裂多肽家族 現(xiàn)已從組織中分離出其它生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、增殖刺激

25、素（MSA）等，這些因子在血清中則含量不高。83細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 現(xiàn)已從組織中分離出其它生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ 激 素 激素多方面對(duì)細(xì)胞作用。胰島素（INS）有促細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸的作用，這些作用可能與其促細(xì)胞分裂相關(guān)。84細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 激 素 激素多方面對(duì)細(xì)胞作用。胰島素（INS）其 它 成 分血清中還含有：氨基酸葡萄糖酮酸一些與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素一些抑制細(xì)胞增殖的成分 85細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)其 它 成 分血清中還含有：85細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（4）水解乳蛋白 常用的天然培養(yǎng)基，水解乳蛋白是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物。含有豐富的氨基酸；用與原代細(xì)胞培養(yǎng)效果很好。

26、 86細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（4）水解乳蛋白 常用的天然培養(yǎng)基，水解乳蛋白是（5）膠 原 膠原是細(xì)胞生長(zhǎng)良好的基質(zhì)，是從動(dòng)物組織中用人工的方法提取出的，利于組織和細(xì)胞的固定，屬于天然培養(yǎng)基。87細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（5）膠 原 膠原是細(xì)胞生長(zhǎng)良好的 膠原主要用于細(xì)胞的附著，能改善細(xì)胞表面的性質(zhì)，促細(xì)胞生長(zhǎng)。膠原可來(lái)自大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛真皮、牛眼水晶體等，其中以鼠尾膠原最為常用和制備簡(jiǎn)便。88細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 膠原主要用于細(xì)胞的附著，能改善細(xì)胞表面的性質(zhì)，促細(xì) 例：鼠尾膠原制法如下：1）取組織：大鼠一只，從尾根切斷鼠尾，置75%酒精中浸泡30分鐘；無(wú)菌條件下，抽出尾腱置平皿中并切成1.5cm小段

27、；2）溶解：取1.5g尾腱浸入150ml醋酸溶液（0.010.25M），置4冰箱中，并不時(shí)搖動(dòng)，48小時(shí)后，移入滅菌離心管；89細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 例：鼠尾膠原制法如下：89細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3）分離：4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，吸取上清液，10磅10分鐘高壓滅菌后分裝入小瓶，-20冰箱保存。4）使用方法：用吸管吸取少許膠原涂于滅菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁上，不宜太厚以傾斜瓶時(shí)不流動(dòng)為準(zhǔn)；90細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)3）分離：4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，吸取上清液，10磅15）向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通以氨氣后封上瓶蓋作用30分鐘（若不用氨氣處理，則置37溫箱過(guò)夜，或置室溫48小時(shí)，再用無(wú)菌水沖洗涼干）。待膠原凝固，然后用

28、無(wú)菌生理鹽水沖洗、涼干，即可使用。91細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)5）向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通以氨氣后封上瓶蓋作用30分鐘（若不用氨氣處理4、合成培養(yǎng)基 （1）定義：按人和動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。 92細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)4、合成培養(yǎng)基 （1）定義：按人和動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞成分模擬合成 合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)，促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個(gè)體差異的影響。目的在于創(chuàng)制出與體內(nèi)相似的生存環(huán)境。合成培養(yǎng)基有固定的組成成分，有利于控制實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化。93細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)，促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個(gè)（2）合成培養(yǎng)基的成分氨基酸：幾乎所有細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高要求，是細(xì)胞賴以

29、合成核酸和蛋白質(zhì)的物質(zhì)。缺少谷氨酰胺細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)不良而死亡。維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞代謝有重大影響?？煞譃樗苄院椭苄詢纱箢悺?94細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（2）合成培養(yǎng)基的成分94細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)無(wú)機(jī)離子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，還需一些微量元素，如Cu2、Zn2、Fe2等。碳水化合物：細(xì)胞生命的能量來(lái)源，也有一些是蛋白質(zhì)和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉、醋酸鈉等。95細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)無(wú)機(jī)離子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，還需一些微量元素其它成分抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽等三磷酸酰苷（ATP）輔酶A核酸降解物如嘌呤與嘧啶類 96細(xì)胞工程

30、學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)其它成分抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽等96細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）合成培養(yǎng)基的分類 97細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（3）合成培養(yǎng)基的分類 97細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)生長(zhǎng)培養(yǎng)液 用以維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。含血清比例大，是培養(yǎng)工作中最主要的培養(yǎng)用液，其組成為： 基本培養(yǎng)基 80%90% 血清(多用小牛血清) 10%20% 抗生素(多用青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml)98細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)生長(zhǎng)培養(yǎng)液 98細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)維 持 液 維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死，血清含量很少，一般細(xì)胞因缺少生長(zhǎng)因子時(shí)不能增殖，生長(zhǎng)緩慢，但發(fā)生轉(zhuǎn)化或癌細(xì)胞因自身有產(chǎn)生促生長(zhǎng)增殖因子的能力，在血清缺少情況下仍能生長(zhǎng)；可

31、用于選擇發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。99細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)維 持 液 維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死，血清含量很少其組成為： 基本培養(yǎng)基 95% 血清 2%5% 注意：如果培養(yǎng)正常細(xì)胞完全不加血清，可維持細(xì)胞不死，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞難免退化。 100細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)其組成為： 100細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)合成培養(yǎng)基的種類Eagle，s、Dulbecco，、Ham，s、CMRL、RPMI、Waymouth，s、MoCoy，s、Iscove，sMEM 、F12、 1066 、 1640 、 MB751/1 、 5A 、 DMEML15、 NCTC109、 199、 Fischer 101細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)合成培養(yǎng)基的種

32、類Eagle，s、Dulbecco，、Ham，細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件 血清中還有一些有害物和抑制物，對(duì)細(xì)胞有去分化的作用，影響細(xì)胞的功能表達(dá)。因此，許多研究工作需要在培養(yǎng)基中不含血清和其他天然培養(yǎng)基。 無(wú)血清培養(yǎng)基研制難度大，要設(shè)計(jì)出一種萬(wàn)能的無(wú)血清培養(yǎng)基非常困難。103細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 血清中還有一些有害物和抑制物，對(duì)細(xì)胞有去分化的 繼續(xù)設(shè)計(jì)新的、能適應(yīng)多種類型體外生長(zhǎng)增殖的無(wú)血清培養(yǎng)基。在研究生長(zhǎng)因子等工作的基礎(chǔ)上，向人工合成培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)加一定的激素、生長(zhǎng)因子等已知物質(zhì)來(lái)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。 無(wú)血清培養(yǎng)基設(shè)計(jì)趨勢(shì)104細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí) 無(wú)血清培養(yǎng)基設(shè)計(jì)趨勢(shì)104細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)6其它常用液 105細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)6其它常用液 105細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（1）消化液 分離組織和分散細(xì)胞用的。如：胰蛋白酶、膠原酶、二乙胺四乙酸二鈉（EDTA）。 106細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)（1）消化液106細(xì)胞工程學(xué)醫(yī)學(xué)知識(shí)胰蛋白酶 采自?；蜇i的胰臟,易潮解，置于陰暗干燥處保存。 主要作用：水解細(xì)胞間蛋白質(zhì)，使細(xì)胞相互離散。 活力表示：以解離酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和特性有密切的關(guān)系。濃度大、溫度高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的分離能力最大，但