免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)培訓(xùn)課件

1、免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 簡(jiǎn)稱S-P法)檢測(cè)胃癌組織CKVimentin的蛋白表達(dá)2免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結(jié)法2免武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異性一抗待測(cè)抗原3免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)流程組織、細(xì)胞標(biāo)本 抗原修復(fù) 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

2、 正常血清封閉 滴加特異性一抗滴加二抗 滴加三抗顯色復(fù)染封片 4免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)流程組織、細(xì)胞標(biāo)本 武漢大學(xué)病理教研室具體步驟如下：1石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；2所有組織均采用微波修復(fù)抗原； 3室溫冷卻后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；4滴加50l過氧化物酶阻斷液（試劑A），37濕盒孵育 10min；50.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；6滴加非免疫性動(dòng)物血清（試劑B），37濕盒孵育 10min；5免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室具體步驟如下：5

3、免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室7甩去多余血清，分別滴加種抗體，4濕盒孵育 過夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；8滴加生物素標(biāo)記的二抗（試劑C），37濕盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min；9滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D），37濕盒孵育 15min，甩去多余液體；10每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約為1-5min），自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染；11常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片并鏡檢分析；12陽性對(duì)照采用已知陽性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照采用PBS取代第一抗體，其余步驟相同。6免疫組織化學(xué)染色SP

4、技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室7甩去多余血清，分別滴加種抗體，4武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)流程中的注意事項(xiàng)內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 血清封閉 沖洗 抗體選擇及一抗孵育時(shí)間檢測(cè)及顯色系統(tǒng)復(fù)染 7免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)流程中的注意事項(xiàng)內(nèi)源性過氧化物酶的滅活武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 取材、脫水、浸蠟組織及時(shí)固定 固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林 4%多聚甲醛常規(guī)下固定8-24小時(shí)取材厚度：2mm8免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 預(yù)防脫片常選用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）應(yīng)嚴(yán)格控制使用次數(shù) 2）玻片潔凈度9免疫

5、組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)培訓(xùn)課件武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 切片保存切片不宜長時(shí)間在常溫下保存11免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 脫臘原則：免疫組化的脫蠟試劑應(yīng)與常規(guī)HE 脫蠟分開12免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理 武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)操作中的應(yīng)用抗原修復(fù) 實(shí)驗(yàn)操作中的注意事項(xiàng) 13免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)操作中的應(yīng)用抗原修復(fù) 13免疫組織化學(xué)武漢大學(xué)病理教研室抗原修復(fù) 影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素 抗原修復(fù)方法分類 1）酶消化法 2）加熱法（高壓法

6、水煮法微波法）抗原修復(fù)液的選擇 1）檸檬酸鹽緩沖液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0） 14免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室抗原修復(fù) 影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素 14免武漢大學(xué)病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 存在部位：紅細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、粒細(xì)胞、 單核細(xì)胞、肝細(xì)胞及腎細(xì)胞消除方法：3% H2O2 浸泡10分鐘15免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶的滅活 存在部位：紅細(xì)胞、武漢大學(xué)病理教研室血清封閉 目的：減少非特異性著色 時(shí)間：一般在加載一抗之前使用 16免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室血清封閉 目的

7、：減少非特異性著色 16免疫武漢大學(xué)病理教研室沖 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分沖洗增加效果 可加入Tween2017免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室沖 洗 一般采用PBS（PH 7.4-7武漢大學(xué)病理教研室一抗孵育時(shí)間及抗體選擇應(yīng)選擇信譽(yù)高、質(zhì)量好的試劑公司抗體切忌反復(fù)凍融一抗為濃縮液時(shí)，需選擇最佳稀釋濃度按說明書可采用 37 1-2 小時(shí)或 4 冰箱過夜18免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室一抗孵育時(shí)間及抗體選擇應(yīng)選擇信譽(yù)高、質(zhì)量好武漢大學(xué)病理教研室檢測(cè)及顯色系統(tǒng)一般采用以生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。如SP、LSABC、ABC等 顯色方法：

8、經(jīng)常采用辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè) 19免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室檢測(cè)及顯色系統(tǒng)一般采用以生物素標(biāo)記的辣根過武漢大學(xué)病理教研室顯色系統(tǒng)常用的酶 1.辣根過氧化物酶(HRP) A:顯色底物DAB-棕黃色 敏感度高、定位清晰、易于觀察、保存 B:顯色底物AEC-磚紅色 2.堿性磷酸酶(AP) 顯色底物:BCIP/NBT-藍(lán)紫色20免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室顯色系統(tǒng)常用的酶20免疫組織化學(xué)染色SP技武漢大學(xué)病理教研室復(fù) 染原則：注意兩者之間對(duì)比，突出陽性信號(hào)21免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室復(fù) 染原則：注意兩者之間對(duì)比，突出陽性信武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì)原則：所有檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照編號(hào)陽性片待檢片陰性對(duì)照結(jié)論1操作失誤，抗體失效2非特異性著色3陽性片不含靶抗原4待檢片不含定位抗原5待檢片含定位抗原22免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì)原則：所有檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)陽性對(duì)照武漢大學(xué)病理教研室結(jié)果分析1.特定的定位 胞膜型、胞漿型、全漿型或胞核型，局限性或彌散性。2.染色的不均一性 陽性切片的染色應(yīng)分布不均，片狀或點(diǎn)狀散在分布；染色強(qiáng)弱也不等，顏色深淺反映抗原量的多少。23免疫組織化學(xué)染色SP技術(shù)武漢大學(xué)病理教研室結(jié)