定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)實(shí)例課件

1、基因有限公司市場部 黃國慶定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)實(shí)例分析 熒光定量PCR的定量方法通用型的熒光染料檢測法 SYBR Green I法 利用熒光染料（如SYBR Green I）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點(diǎn)是：無需另外設(shè)計(jì)熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀，缺點(diǎn)是專一性不如探針法 。特異性的熒光探針法 Taqman探針法 利用熒光標(biāo)記的特異性探針和引物來識(shí)別模版，優(yōu)點(diǎn)是特異性更高，適用于序列專一擴(kuò)增檢測，不過增加了熒光探針的成本。 定量PCR實(shí)驗(yàn)基本流程準(zhǔn)備模板(DNA或RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA)PCR反應(yīng)(DNA

2、/cDNA+引物探針+PCR mix)樣品編輯(樣品名、樣品類型)設(shè)置參數(shù)(循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)體積、熔解曲線)運(yùn)行PCR，自動(dòng)分析數(shù)據(jù)模板的制備RNA樣品 real time RT-qPCR 是檢測樣本中特定基因表達(dá)量的有效方法，包含逆轉(zhuǎn)錄步驟和定量PCR步驟。組織或細(xì)胞總RNA抽提，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行定量PCR.DNA樣品 組織或細(xì)胞的DNA抽提總RNA的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法 1.檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。

3、R在1.82.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是2.2的）。R1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，當(dāng)R2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。 2.RNA的電泳圖譜 電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好。 RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn) 項(xiàng)目合格不合格備注Ratio2.0 X1.8X1.8或X2

4、.2 一般是1.82，但不能高于2.2，如果高于2.2可能是完全水解了。電泳條帶 28S、18S條帶應(yīng)清晰銳利，并且28S條帶的亮度在18S條帶的兩倍或者兩倍以上，無DNA雜帶 28S、18S條帶不清晰銳利，有向前拖尾。28S條帶的亮度與18S條帶亮度相當(dāng)或者更低，有DNA雜帶 這項(xiàng)指標(biāo)是關(guān)鍵性指標(biāo)低溫實(shí)驗(yàn) 70條帶和-20條帶無明顯差異。 70條帶和-20條帶有明顯差異。 如果內(nèi)源性RNA酶的污染，兩者間的條帶差異是非常明顯的。引物的設(shè)計(jì)原則上下游引物要保守 為了能夠擴(kuò)增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200bp片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上下游引物的長度一般為18-30bp之間，且Tm值在

5、58-62之間，上下游引物的Tm值相差最好不超過2。確保引物中GC含量在30-80%。應(yīng)避免引物中多個(gè)重復(fù)堿基的出現(xiàn)，尤其是要避免4個(gè)或超過4個(gè)G堿基出現(xiàn)。引物的3端最好不為G或/和C。引物3端的5個(gè)堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個(gè)G或/和C。避免引物內(nèi)出現(xiàn)反向重復(fù)序列形成發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也應(yīng)避免引物間配對形成引物二聚體?？缤怙@子設(shè)計(jì)引物，用于區(qū)別或消除基因組DNA的擴(kuò)增。SYBR I染料法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案Components Final Conc.DNA4-40 ng （25ul）PCR buffer1dNTPs各0.2mMMgCl225 mM Forward Primer0.2-0.4uMReverse P

6、rimer0.2-0.4uMSYBR Green I0.21Taq酶 12UDDH2O補(bǔ)足總體積20ulTips：提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應(yīng)的抑制作用。我們建議在用SYBR Green I進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，鎂離子濃度要比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)要高出 0.5 到3mM。Taqman探針法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案Components Final Conc.DNA4-40 ng （25ul）PCR buffer1dNTPs各0.2mMMgCl224 mM Forward Primer0.2-0.4uMReverse Primer0.2-0.4uMTa

7、qman0.2uMTaq酶 12UDDH2O補(bǔ)足總體積20ulTips：2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為cDNA(1-100 ngRNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA) 模板時(shí)的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。 引物二聚體的解決（一）1.引物的設(shè)計(jì)問題 如何判斷問題產(chǎn)生于引物的設(shè)計(jì)？常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)中能否通過調(diào)節(jié)退火溫度消除引物二聚體常規(guī)PCR是否同樣存在大量引物二聚體 如果常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)無法消除二聚體，則說明二聚體是由引物設(shè)計(jì)造成的，需從新設(shè)計(jì)引物退火溫度的問題 如果以2為溫度梯度，提高退火溫度，尋找最佳的退火溫度引物二聚體的解決（續(xù)） 4.軟件操作、

8、程序設(shè)置 用四步法可以去除引物二聚體，就是在PCR延伸之后加一個(gè)介于二聚體Tm與目片段Tm之間的溫度,在這個(gè)溫度采集信號(hào)即可，這樣二聚體產(chǎn)生的熒光信號(hào)就檢測不到Cycle（40）94 15s59 20s72 20s83 采集信號(hào)基因組DNA的污染跨內(nèi)含子的引物將引物設(shè)在兩個(gè)外顯子的結(jié)合部，以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)在內(nèi)含子的前面設(shè)計(jì)5引物，在內(nèi)含子的后面設(shè)計(jì)3引物，以基因組DNA 和cDNA 為模板的PCR產(chǎn)物大小不一樣,達(dá)到去除污染的目的2. 將RNA 提取物用RNase-free 的Dnase I 處理，Dnase I滅活時(shí)RNA可能降解跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物

9、（二）PCR效率對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響擴(kuò)增效率低（擴(kuò)增效率不一致）擴(kuò)增效率低，可適當(dāng)提高體系中Mg2+的濃度，以50nM為梯度降低Sybr-Green的濃度，一般在0.2-1之間調(diào)節(jié)如果同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)基因，而擴(kuò)增效率不一致，請首先明確以下問題：兩組引物的退火溫度是否一致或接近兩條擴(kuò)增片段長度和GC含量是否一致或接近 如果上述兩點(diǎn)有一點(diǎn)不能滿足就會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率不一致，需從新設(shè)計(jì)引物 。特別是在做相對定量分析時(shí)，應(yīng)盡量將兩條目的片段的擴(kuò)增長度和引物的退火溫度設(shè)計(jì)接近 實(shí)例分析Case by case標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不規(guī)范：SYBR Green(R) I 2006-05-16 (1)wang.rex；SYBR Green(R) I 2006-06-11 (1)fu.rex稀釋樣品的水污染：SYBR Green(R) I 2006-03-16 (2)fan.rexPCR管質(zhì)量問題：Run 2006-07-06 FYD.rex；060721-1FYD.rex試劑盒的問題：2005120701香港，Dual Labeled 試劑盒實(shí)例分析Case by case（續(xù)）熒光閾值的調(diào)節(jié)：051107-ct gz二聚體的問題：SG-Qiagen-CD民